免疫親和柱凈化-HPLC-FLD法測定天麻藥材中黃曲霉毒素的含量

張玉蓮　宋　嬿　鄭希望

（上海上藥華宇藥業有限公司，上海200001）

0　引言

黃曲霉毒素是一類化學結構類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，主要是由黃曲霉（aspergillus flavus）、寄生曲霉（a.parasiticus）產生的次生代謝產物，它們存在于土壤、動植物、各種堅果中，是霉菌毒素中毒性最大、對人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。1993年，黃曲霉毒素被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為1類致癌物。

目前已發現的黃曲霉毒素有二十余種，主要的有B1、B2、G1、G2四種，其中毒性最強的為B1。

天麻（Gastrodiae rhizome）來源于蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，其具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效，是名貴中藥材。研究并建立天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的測定方法，可以為天麻藥材質量的評價與控制提供依據。

本研究采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜（HPLC）-熒光光度檢測（FLD）法，測定天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。

1　材料與儀器

1.1　材料

1.1.1天麻藥材

天麻藥材均從各產地直接購買，并經上海市中藥行業專家張增良老師鑒定為天麻Gastrodiae rhizoma。

1.1.2主要試劑

乙腈、甲醇（色譜級），購自德國默克公司；氯化鈉（優級純）、碘（分析純）、吐溫-20，購自國藥化學試劑公司；免疫親和柱，購自美國Beacon公司；黃曲霉毒素混合對照品（98%），購自上海安譜公司；PBS緩沖液，購自德國GE公司；親水性PTFE微孔濾膜（25 mm×0.45μm），購自上海駟虎科技公司。

1.2　儀器

1.2.1儀器配置

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（配套FLD檢測器），安捷倫公司；Pickering Vector柱后衍生化儀，美國Pickering公司；METTLER TOLEDO XS205DU分析天平，梅特勒-托利多公司；Anke TDL-5000B離心機，上海安亭公司；Milli-Q Reference純水機，密理博公司。

1.2.2色譜條件

色譜柱：安捷倫Poroshell EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：甲醇:乙腈:水=18:18:62；流速：1 mL/min。

FLD檢測器激發波長360 nm，發射波長450 nm，PMTGAIN值15；相鄰兩個峰的分離度應大于1.5。

柱溫35℃的柱后衍生化法：衍生溶液為0.05%的碘溶液（取碘0.5 g，加入甲醇100 mL使其溶解，用水稀釋至1 000 mL），衍生化泵流速0.3 mL/min，衍生化溫度70℃。

進樣量：20μL。

2　方法

2.1　標準溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混合對照品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的標示濃度分別為1.0 μg/mL、0.3 μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL，純度均為98%）1 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備液；精密量取儲備液1 mL，置于5 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2　供試品溶液的制備

精密稱定天麻藥材粉末2 g，置于50 mL離心管中，加入50%乙腈水溶液30 mL，用手持勻漿機高速攪拌2 min，加入氯化鈉2.5 g，振搖或渦旋至溶液分層，離心5 min（離心速度4 000 r/min）；精密量取上清液6 mL，置于50 mL離心管中，加含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液40 mL，搖勻，全部轉移至免疫親和柱（以少量緩沖液多次潤洗離心管，并轉移至免疫親和柱），流速3 mL/min，用20 mL水洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入柱子將水擠出，加入甲醇1.4 mL洗脫，收集洗脫液，置于2 mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，取續濾液，即得。

2.3　測定方法

2.3.1標準曲線的繪制

取稀釋后的混合標準品溶液進樣，進樣體積分別為1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，測定峰面積，計算標準曲線。

2.3.2樣品測定

取20μL供試品溶液注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計算，即得。

2.4　方法學考察

2.4.1線性關系考察

按照2.3的測定方法，對不同濃度的混合標準品溶液進行測定，以測量值為縱坐標，濃度為橫坐標，建立回歸曲線，計算線性回歸系數。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的相關系數及回歸方程如表1所示。

2.4.2加標回收率考察

精密稱定天麻藥材粉末2 g，置于50 mL離心管中，精密加入0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL混合對照品儲備溶液，混勻，3個不同濃度的儲備溶液每個平行制備3份，再精密加入50%乙腈30 mL，按照2.2項的方法，自“用手持勻漿機高速攪拌2 min”起，同法制備。

按照2.3項的方法進樣測定，計算回收率，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2加標回收率結果如表2所示。

表1　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的相關系數及回歸方程

2.4.3精密度考察

按照2.4.2加標回收率中的處理方法，添加0.5 mL混合對照品儲備液，平行制備6份，進樣測定，計算含量RSD。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2精密度試驗結果如表3所示。

2.4.4檢出限和定量限考察

以回收率試驗中的低濃度樣品為例計算信噪比，根據3倍信噪比值和10倍信噪比值對應的黃曲霉毒素含量，計算檢出限和定量限。

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢出限和定量限試驗結果如表4所示。

3　結果與分析

3.1　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2線性回歸方程及相關系數

由表1可知：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在各自濃度范圍內有良好的線性關系，相關系數r均≥0.998 5。

3.2　加標回收試驗結果

由表2可知：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的回收率在87%～108%之間，方法準確可靠，可用于天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測定。

3.3　精密度試驗結果

由表3可知：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的精密度試驗RSD分別為1.3%、0.9%、3.5%、2.9%，精密度良好。

3.4　檢出限和定量限試驗結果

由表4可知：檢出限和定量限試驗結果符合規定，該檢測方法可用于天麻藥材中黃曲霉毒素的定量測試。

4　不同產地天麻藥材中黃曲霉毒素的含量測定結果

按上述制定的檢測方法，對6個產地共13個批次的天麻藥材中的黃曲霉毒素含量進行了測定，測定結果如表5所示。

由表5可知：全部批次均未檢測出黃曲霉毒素，結果符合以下規定：（1）《中國藥典》（2015年版），黃曲霉毒素B1≤5 μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量≤10μg/kg；（2）《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》，黃曲霉毒素B1≤5 μg/kg；（3）《美國藥典》，植物藥中的黃曲霉毒素B1≤5μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量≤20 μg/kg。

表2　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2加標回收率

表3　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2精密度試驗結果

表4　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢出限和定量限試驗結果

5　結語

（1）本研究在前處理階段采用50%乙腈水溶液提取的方法，經過加鹽分層，可以去除大部分的水溶性雜質，降低水溶性雜質對免疫親和柱的干擾。同時，使用淋洗液可以促進提取液中雜質成分的溶解，降低其在免疫親和柱上的吸附，從而提高免疫親和柱的純化效果，減少雜質干擾，有助于實現天麻中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量檢測。

（2）本研究無需使用微孔濾膜或玻璃纖維濾膜過濾，降低了實驗成本，減少了前處理時間。

（3）本研究共收集了6個主產區的13批天麻藥材，均未檢測出黃曲霉毒素，表明經規范生產、加工、運輸及貯存的天麻不易受黃曲霉菌的侵染。