復合大孔聚多糖止血材料的制備及其體外性能研究

許零　馬曉春　曾莉君

[摘要] 目的 初步評價復合大孔聚多糖止血材料的止血效果，研究其體外性能。 方法 輻照交聯法制備復合大孔聚多糖止血材料，通過紅外及理化測試表征材料的結構、降解性能及凝血性能。 結果 止血材料經輻照后分子發生交聯，吸水率達3456%；體外降解實驗表明，止血材料降解性能良好，在溶菌酶溶液中3 d即可降解68%，20 d內則降解完全；材料的體外凝血時間為（25.33±2.45）s，能吸附更多的紅細胞和血小板，血凝塊強度更大。 結論 輻照交聯技術制備的復合大孔聚多糖止血材料具有較好的吸液性能和凝血性能，在傷口止血方面具有良好的應用前景。

[關鍵詞] 輻照交聯；羧甲基殼聚糖；止血材料；體外降解；凝血

[中圖分類號] R318.08 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0017-04

Preparation of the macroporous polysaccharide hemostatic complex materials and study on its performance in vitro

XU Ling1 MA Xiaochun1 ZENG Lijun2 CHEN Miaoyuan2 WANG Yun2 JU Xuecheng1 QIU Ximei1

1.Peking University Shenzhen Institute， Guangdong Province， Shenzhen 518057， China； 2.Xiamen Gelfeel Biological Technology Co.， Ltd.， Fujian Province， Xiamen 361026， China

[Abstract] Objective To evaluate the hemostatic effect of the macroporous polysaccharide hemostasis complex materials preliminarily， and to investigate the performance of the materials in vitro. Methods The hemostatic materials were prepared by γ-irradiation crosslinked method， and its structure， degradation in vitro and clotting performance were characterized by infrared spectrum and physicochemical test. Results The results showed that the crosslinked carboxymethylated-chitosan molecules had been made after the materials were irradiated， and its water absorption was of 3456%. The biodegradable degradation of the materials in lysozyme solution was 68% after 3 days and the degradation completed within 20 days. The clotting time was （25.33±2.45） s， which indicated the material adhered more red blood cells and platelets and showed the stronger blood clots. Conclusion The macroporous polysaccharide hemostasis complex materials prepared by γ-irradiation crosslinked method possess great solution absorption performance and blood coagulation performance， which has good application prospect in wound hemostasis.

[Key words] Radiation cross-linking： Carboxymethyl chitosan； Hemostatic material； Degradation in vitro； Blood coagulation

大多意外死亡均是由于未及時止血導致失血過多而引起的[1-3]。目前在臨床中使用的止血方法主要是用外科手術，然而此方法無法進行大面積范圍的止血，在止血過程中因使用器械而產生的熱量會導致傷口及周圍組織不必要的變形損傷[4]。因此，止血材料的研究至關重要。止血材料具有傷口止血、促進愈合的作用[5]，目前報道的快速止血材料主要有多孔沸石、植物淀粉類、氧化再生纖維素類、膠原類材料以及殼聚糖類等[6-13]，但在臨床應用中可供選擇的功能完善的止血材料種類較少，且存在體內難以降解、止血效果差、生物相容性差等缺點。在眾多的止血材料中，殼聚糖類止血材料已被廣泛用于制造藥物載體、人工真皮、可吸收手術縫合線及防粘連材料等[14]。殼聚糖經羧甲基化形成的羧甲基殼聚糖衍生物由于其無毒、無刺激、可生物降解并且具有良好的生物安全性等天然特性[15-19]，使其漸漸成為科學研究的熱點。此外，輻照交聯作為一種新型技術，通過電子加速器產生的電子束或Co-60、γ射線輻照物質，產生的自由基引發聚合物分子交聯，從而改變其分子結構及物理性能[20]。輻照技術一方面省去了加熱步驟，避免因高溫導致材料變性；同時避免了外源性有毒化學物質的引入，很大程度上降低了細胞毒性。本研究采用輻照交聯結合冷凍干燥技術制備復合大孔聚多糖止血材料，通過紅外及理化測試表征材料的結構、降解性能及凝血性能，初步評價復合大孔聚多糖可吸收生物材料在臨床應用中的應用前景，為解決國內體內止血材料稀缺問題提供選擇的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭兔（來源：上海維通利華實驗動物有限公司），雄性，（2.0±0.2）kg，5～6個月，普通級。實驗動物合格證號：2007001105992。動物的使用已得到北京大學實驗動物福利倫理審查工作委員會的批準，批準號：AAIS-XuL-1。試驗期間給予標準飼料，供應充足，自由攝食，自由飲水，晝夜12 h交替光照，室溫（20±2）℃中飼養。

1.2 儀器與試藥

儀器：冷凍干燥機（LGJ-18A，北京四環科學儀器廠有限公司）；紅外光譜儀[MPA，布魯克（北京）科技有限公司]；掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi High-Technologies Corporation）；高速臺式離心機（TGL-16M，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；質構儀（TA.XT.plus，Stable Micro Systems，Ltd.）。

試藥：溴化鉀（天津市北辰方正試劑廠，批號：150902）；磷酸氫二鈉（西隴化工股份有限公司，批號：150902）；疊氮化鈉（山東西亞化學股份有限公司，批號：S7470）；氯化鈣（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150119）等，試劑均為分析純。溶菌酶（Aladdin，D1507040，≥8000 units/mg）、檸檬酸鈉抗凝血劑（西隴化工股份有限公司，批號：151129）；抗凝劑與血液的比例為1∶9。

1.3 實驗方法

1.3.1 輻照交聯 采用輻照交聯制備復合大孔聚多糖止血材料，羧甲基殼聚糖及定量明膠與水在合適溫度下按一定比例混合均勻，利用電子加速器進行輻照交聯。得到的水凝膠經冷凍干燥后獲得新型的復合大孔聚多糖止血材料。輻照溫度為20℃；吸收劑量為25 kGy。

1.3.2 紅外光譜 將未輻照原料及輻照交聯法制備的復合大孔聚多糖止血材料，粉碎成約0.15 mm的粉末，采用KBr壓片法在400～4000 cm-1波數下測試其紅外光譜圖，觀察交聯前后羧甲基殼聚糖的分子結構。

1.3.3 吸水性能 取輻照交聯制備的復合大孔聚多糖止血材料（m0）適量，以1∶100浸漬于純化水中，在（37±1）℃條件下浸漬一段時間后過濾，稱取水凝膠樣品（m），按式（1）、（2）分別計算材料的吸水率及吸水速率：

吸水率（%）= ×100（1）；

吸水速率=吸水率/吸水時間（2）。

1.3.4 體外降解 實驗以含有一定濃度的溶菌酶的PBS溶液為復合大孔聚多糖止血材料的體外降解液，模擬止血材料用于體內的止血環境。精密稱取適量的復合大孔聚多糖止血材料（稱重，記為m1）按10 mg/mL溶解于PBS溶液中（pH 7.2～7.4），加入一定量的溶菌酶（8 kU/mg）及疊氮化鈉，置于37℃烘箱中降解，一定時間后將降解液水浴，離心后去掉上清液，將未降解完全的止血材料在37℃烘箱中烘干，稱重（m2），按式（3）計算降解率：

降解率（%）= ×100（3）。

1.3.5 體外凝血性能 血細胞黏附：取新鮮血液，于離心半徑4 cm、1500 r/min條件下離心15 min，分離得到的含高濃度血小板的血漿和富紅細胞血液，將止血材料均勻粘貼在膜上，與新西蘭兔富含紅細胞液（沉淀）及富血小板血液（上清液）按照一定比例混合，固定，PBS溶液反復洗滌，干燥后噴金，進行觀察，選區軟件對選區內細胞數目進行統計。凝血時間：將止血材料與新西蘭兔新鮮血液按照一定比例混合，計時，振蕩以充分接觸，傾斜試管45°，當血液不隨試管傾斜時為凝血態，停止計時，記錄凝血時間。血凝塊強度測試：將止血材料與新西蘭兔新鮮血液按照一定比例混合，20 min后利用質構儀對血塊壓縮強度進行測試，測試速度=1 mm/s，壓縮距離為0.5 mm。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計軟件進行分析處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 材料的結構

圖1為復合大孔聚多糖止血材料與原料羧甲基殼聚糖的紅外光譜圖。圖1A是未交聯的原料羧甲基殼聚糖的紅外圖譜，由圖1A可知，波數3449 cm-1的強寬特征峰為O-H和N-H的伸縮振動；2885 cm-1和1327 cm-1分別為C-H的伸縮振動和彎曲振動；1624 cm-1和1410 cm-1分別為-COOH的不對稱和對稱伸縮振動；1064 cm-1則為伯醇（-CH2OH）所生產的醚鍵（-C-O-C-）的伸縮振動。羧甲基殼聚糖經輻照交聯后，由圖1B可知，在3745 cm-1處振動峰消失，3449 cm-1的特征峰變鈍變寬。此外，1624 cm-1處-COOH的不對稱伸縮振動峰向高波數方向偏移至1647 cm-1。

2.2 材料的吸水性質

圖2為復合大孔聚多糖止血材料的吸水率及吸水速率圖。由圖2可知，材料的吸液行為主要發生在前5 min。吸水率隨浸漬時間的延長逐漸增大，在浸漬時間為30 min時吸水率高達3456%。

2.3 止血材料的體外降解性能

圖3為輻照交聯后復合大孔聚多糖止血材料的體外降解情況。在體外降解條件下，材料降解率隨著降解時間的延長而逐漸增加，在模擬體外降解條件1 d后降解率不小于50%，3 d降解68%，止血材料在前3 d降解速率較快，大部分被降解，200 mg的止血材料在20 d已能被完全降解。

2.4 止血材料的凝血性能

研究比較低溫輻照交聯制備的止血材料及常溫組材料的血細胞黏附情況，見圖4。低溫組的止血材料比常溫組吸附了更多的紅細胞和血小板，其中，紅細胞吸附數量約為常溫組的2.5倍，而血小板的吸附則高達6倍。低溫組和常溫組樣品紅細胞吸附數量和血小板吸附數量比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。凝血時間及血塊強度數據如表1所示，輻照交聯后制備的止血材料的凝血時間明顯短于空白樣品，血塊強度明顯大于空白樣品，差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

羧甲基殼聚糖分子經輻照后，在3745 cm-1處振動峰消失，3449 cm-1的特征峰變鈍變寬，表明輻照后分子中的-OH基團減少，分子形成氫鍵，繼而發生締合作用，1624 cm-1處-COOH的不對稱伸縮振動峰向高波數方向偏移至1647 cm-1，表明-COOH官能團的化學鍵增強。因此，羧甲基殼聚糖分子經輻照后已成功交聯。輻照交聯復合大孔聚多糖止血材料通過吸收血液中的水分及周圍體液導致其孔隙結構幾乎被液體所填滿。止血材料的吸水過程主要在前30 min內完成，這是傷后出血的黃金救援期時間，對傷口止血具有重要意義。復合大孔聚多糖止血材料高的吸水率表明該止血材料擁有大的吸水容量、極強的吸液能力，使其止血效果更顯著。材料的吸液行為主要發生在前5 min，這是由于在與水溶液接觸最開始的5 min內吸水速率最快，即材料與液體接觸后能夠短時間內迅速吸收液體，這有利于止血材料迅速吸收血液中的水溶液，繼而促進凝血，隨著浸漬時間的延長，材料的吸水率增加緩慢，吸水速率減慢。機體血液及體液中含有大量的溶菌酶，而溶菌酶能夠水解殼聚糖中的β（1～4）糖苷鍵，這對殼聚糖進入體內后的降解起到極其重要的作用。因此表征殼聚糖在體外溶菌酶溶液中的降解效率，在一定程度上可以說明殼聚糖在機體內的降解情況。由體外降解實驗可知，止血材料在3 d即可降解68%，20 d內即降解完全。止血材料凝血性能研究，包塊血細胞黏附、凝血時間及血凝塊強度，表征了止血材料在體外使血液凝固的能力。凝血血塊強度則是表征止血材料止血性能及預防傷口再次出血的重要指標。凝血實驗顯示，輻照交聯后制備的止血材料吸附紅細胞及血小板的能力明顯提高。這是由于輻照交聯的止血材料具有多孔結構及較大的比表面積，在微觀上體現為吸附紅細胞及血小板的能力增強，宏觀上則為凝血時間的縮短。止血材料的強吸附能力導致形成更穩定以及更強的血塊。意味著輻照交聯后復合大孔聚多糖止血材料具有更好的凝血性能。

綜上所述，輻照交聯技術制備的復合大孔聚多糖止血材料展現了較好的吸液及凝血性能，在傷口止血方面具有良好的應用前景。

志謝：感謝對本研究提供資助的廣東省深圳市科技計劃項目（JCYJ20150616163111759），福建省廈門市第五批“雙百計劃”項目和福建省廈門市科技計劃項目（3502Z20151087）。

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（收稿日期：2017-12-08 本文編輯：張瑜杰）