Wnt信號通路與骨質疏松治療的相關研究進展

王國柱　肖斌　董博

[摘要] 成人骨骼是一種經過不斷重塑的多功能器官。骨骼的內穩態需要破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成之間的平衡；如果這種平衡失調將導致骨質疏松癥、硬化性骨病等各種骨骼疾病的發生。為了找到有效和安全的治療方法來調節骨形成，必須闡明骨細胞分化和活動的分子機制。人類和小鼠的基因研究已經確立了Wnt信號作為刺激成骨細胞分化和活性的關鍵機制。本文就Wnt信號通路與骨形成相關機制以及治療骨質疏松方法的相關研究進行綜述。

[關鍵詞] 骨細胞；Wnt信號；骨質疏松；綜述

[中圖分類號] R589 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0029-04

Research progress of Wnt signaling pathway and osteoporosis treatment

WANG Guozhu1 XIAO Bin1 DONG Bo2 YAO Jie2 CHEN Zhihui1 QIAN Bing1 Zhang Liping1

1.Department of Orthopedics， the Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712000， China； 2.Department of Orthopedics， Affiliated Hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712000， China

[Abstract] Adult bone is a multifunctional organ that has been continuously reshaped. The homeostasis of bone requires the balance between osteoclast bone absorption and osteogenesis. If this imbalance can lead to osteoporosis， sclerosing osteopathy and other bone diseases. In order to find effective and safe treatment methods to regulate bone formation， the molecular mechanism of bone cell differentiation and activity must be elucidated. Gene researches in humans and mice have established Wnt signaling as a key mechanism for stimulating osteoblast differentiation and activity.This paper reviews the related mechanisms of Wnt signaling pathway and bone formation and the treatment of osteoporosis.

[Key words] Bone cell； Wnt； Osteoporosis； Review

骨細胞主要存在于骨礦化基質中提供骨支撐。成人骨骼一直處于重塑的狀態，這對于維持正常的骨骼結構和功能非常重要。成骨細胞和破骨細胞是參與骨重塑過程的兩個主要細胞[1]。健康成人骨重塑過程中需要依靠體內的骨吸收和骨形成過程的動態平衡。在人類生活中，隨著年齡的不斷增長以及相關骨代謝異常情況下，骨重塑的動態平衡遭到破壞：若骨吸收超過骨形成將導致骨量的丟失，嚴重患者會出現骨質疏松；反之，將出現骨量的增加的相關疾病。因成骨細胞是骨形成的最主要的細胞類型，因此闡明成骨細胞分化和活性的調節機制不僅可以了解骨的生理機能，而且可設計出有效的治療骨疾病的方法。目前關于骨機制的研究主要集中在內分泌、旁分泌以及轉錄調節方面[2]。這些研究沒有涉及到關鍵的生長因子：Wnt蛋白和骨重建過程關系密切，可通過多層面調節相關蛋白表達來影響骨的形成和吸收[3]。對骨質疏松發病機制的深入研究及治療方案探索有一定的指導意義。

1 Wnt信號通路的概述

Wnt信號通路在骨骼的維持和修復過程中起到關鍵作用。Wnt蛋白在小鼠和人類功能相似，均為參與胚胎、器官和形態發生過程的分泌型糖蛋白家族，是成骨細胞分化和活性的關鍵調控因子，通過自分泌或者旁分泌發揮作用[3]。至少存在19個與人類密切相關的Wnt基因家族成員，含有約350個氨基酸殘基[4]。Wnt信號由卷曲蛋白（Frizzled）家族和低密度脂蛋白（LRP）家族的一種受體組成的跨膜蛋白結合受體所轉導[5]。Wnt與Frizzled受體及共同受體的結合后可激活細胞內GTP酶、鈣調蛋白依賴性激酶2（CaMK2）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶A（PKA）和AKT等[6]多個不同的細胞內的信號級聯反應。

2 Wnt/β-catenin信號通路

依據Wnt蛋白轉導信號的方式將Wnt信號通路劃分為經典的β-catenin-依賴性通路和非經典的β-catenin-獨立通路。

經典的Wnt通路可使β-catenin處于穩定，并通過轉位使β-catenin進入細胞核。β-catenin由Catnnb1編碼，是一種重要的轉錄聯合激活劑，負責調控基因轉錄，以響應Wnt信號的傳導。在經典Wnt信號通路中，β-catenin是通路中最為關鍵和核心的信號轉導因子，廣泛的分布于細胞質和細胞膜[7]。正常情況下，在未接觸配體的細胞中，β-catenin的細胞質水平與β-catenin破壞復合體的相互作用保持在低水平。Wnt配體激活的通路由許多因素決定，包括特定的配體受體相互作用，不同的受體/共受體作用，或存在的細胞內蛋白等共同調節β-catenin活性[8]。Wnt蛋白通過與Fzd受體復合體結合，使LRP受體復合體磷酸化。糖原合成酶激酶-3β（gsk-3β）和軸素蛋白（Axin）在配體受體復合體中被激活。這一復合物隨后可通過吸收的方式進入多泡內胚層，并直接作用于β-catenin，抑制其降解，以此達到胞質內β-catenin的穩定和積累[9]。Jho等[10]的研究表明，穩定的β-catenin通過轉位進入到細胞核中，與高移動性組（HMG）-型轉錄因子家族的淋巴增強因子/T細胞因子（Lef/Tcf）相互作用，激活處于抑制狀態的靶基因，從而刺激目標基因進行表達。

3 Wnt信號通路與骨細胞

3.1 Wnt信號與成骨細胞

Wnt/β-catenin信號通路在整個骨骼的生長、發育以及修復和重建過程中起著關鍵的調控作用。Maupin等[11]的實驗證明Wnt信號在整個骨形成過程中成骨細胞的增殖分化和破骨細胞的抑制都需要β-catentin的參與。Chen等[12]的研究表明β-catenin可在調節骨形成的同時調節骨吸收，通過兩方面共同作用來控制骨量。β-catenin是骨形成的必要條件，并在成骨細胞分化的多個階段作用，以調節成骨細胞和破骨細胞。在成骨細胞分化過程中，β-catenin發揮作用時作用的直接靶基因并沒有得到確定性的研究結果，但是β-catenin與Tcf1的結合已被證明可以直接刺激Runx2轉錄[13]。骨保護素（OPG）在Wnt通路過程中編碼一個抗破骨細胞因子，被認為是β-catenin促進成骨細胞分化時發揮作用的直接目標[14]。雖然β-catenin在骨骼中的重要性已經確立，但β-catenin獨立的Wnt信號對骨骼形成的作用正變得越來越清晰。多個Wnt蛋白可激活哺乳動物雷帕霉素復合物1（mTORC1）的絲氨酸激酶，促進蛋白質合成和骨形成。增強或減弱小鼠mTORC1的一項遺傳研究進一步證實了mTORC1對骨形成的刺激作用[15-16]。此外，Wnt激活mTORC2，以響應機械負荷或抗硬化的中和抗體[17-18]。由于mTOR通路是營養傳感和代謝調控的核心，Wnt信號已經成為成骨細胞調節細胞代謝的重要機制。Hu等[19]發現Wnt3a可激活前成骨細胞和成熟的成骨細胞中的PI3K/AKT、ERK信號通路抑制細胞的凋亡促進成骨。Wnt1、Wnt7b、Wnt10b、Wnt16等多個Wnts蛋白已被證明可以有效參與調節骨形成[5，15]。

3.2 Wnt信號調節骨髓間充質干細胞向成骨轉化

Wnt信號通路在骨髓間充質干細胞（BMSC）向成骨細胞分化的過程中發揮著重要作用。關于BMSC的研究比較廣泛，BMSC是促進骨和其他間充質組織再生的多功能細胞，能保持其自我更新能力，并具有分化為骨組織的潛力，使它們成為臨床應用修復或重建骨缺損的有吸引力的候選體[20]。BMSC向成骨細胞分化受到抑制的同時，脂肪細胞的分化將會增多，這將導致骨質疏松的發生。在促進BMSC向成骨細胞的分化的同時抑制其向脂肪細胞的分化可有效減少骨吸收的同時促進骨形成，可作為骨質疏松的有效治療方法[21-22]。Wnt信號通路可促進BMSC向成骨細胞轉化，抑制其向脂肪細胞和破骨細胞等的分化。β-catenin的積聚也可促進MSC的成骨分化。在小鼠BMSC中的基因編碼中敲除β-catentin基因，可導致成骨細胞分化缺失，進而出現骨骼發育嚴重缺陷。Yu等[23]發現Wnt4通過Wnt通路抑制巨噬細胞和破骨前體細胞中TGFβ激活激酶1介導的NF-κB，抑制BMSC向成骨方向分化。

最近，人類的外顯子測序發現了Wnt1基因與早期發病的骨質疏松癥和骨生成不全癥相關的多種突變密切相關[24]。與人類的研究結果一致，小鼠的基因研究已經證實了Wnt信號與骨形成之間存在明顯的因果關系。在全球的成骨細胞研究中缺乏Lrp5的小鼠具有明顯的骨質減少，而突變Lrp5等位基因的表達與人類的高骨質量綜合征有關，可明顯增加小鼠的骨質量[25]。Maruyama等[26]研究發現，靶向缺失Wnt配體的分泌的Gpr177，可明顯抑制小鼠的骨形成。值得注意的是，由于個體Wnt配體或Fzd受體缺失導致的骨表型比Gpr177敲除小鼠的骨質表型要輕，這就說明Wnt配體和Fzd受體之間存在顯著的功能冗余。這一觀點與成骨細胞在發育過程中表達多個Wnt配體的事實是一致的[27]。

4 Wnt信號抑制蛋白在治療骨質疏松的應用

4.1 糖原合成酶激酶-3β

研究發現骨代謝過程中GSK-3β也是Wnt/β-catenin信號通路中的一個核心成員[28]。GSK-3β與Axin 、腺瘤息肉病桿菌（APC）和酪蛋白激酶1（CK1）共同形成復合體降解β-catenin。GSK-3β抑制劑可降低GSK-3β活性，減少GSK-3β對β-catenin 的降解，增加胞質內β-catenin積累和轉位，通過增強Runx2轉錄因子，促進成骨細胞的成骨分化。GSK-3β抑制劑可作用于Wnt/β-catenin信號通路調節骨形成和骨代謝過程。El-Hoss等[29]通過與正常野生小鼠比較，存在GSK-3β基因缺陷的小鼠β-catenin和Runx2的水平明顯增強，在受到嚴重骨損傷后骨的再生率增強。此外，GSK-3β抑制的小鼠，骨折愈合速度明顯增快，骨質強度也得到增加。GSK-3β抑制劑的相關研究已證實能其能促進骨質疏松大鼠的骨形成，增加骨量和促進骨生物力學性能的恢復[30]。也有嚙齒類動物實驗研究發現[31]，GSK-3β受到抑制后破骨細胞的數量并沒有受到影響以及減少卵巢切除后小鼠骨誘發質疏松的發生率。甚至在健康骨中抑制GSK-3β出現破骨細胞數目未受影響，或略有增加。這些報道表明GSK-3β抑制根據病理狀態對骨組織影響不盡相同。

4.2 骨硬化蛋白

骨硬化蛋白（SOST）主要表達于成熟的骨細胞中，是骨形態發生蛋白（BMP）的抑制因子，對骨形成活動起抑制作用。Semenov等[32]發現SOST可與成骨細胞Lrp5/6的胞外域結合，從而競爭性的抑制阻斷Lrp5/6與Wnt蛋白的結合，干擾其與Wnt蛋白的相互作用，使β-catenin蛋白在細胞質中被GSK-3β降解，這樣β-catenin蛋白在細胞核內與Tcf/Lcf的結合減少。以影響成骨細胞的分化和增殖，使成骨活動受到影響。SOST單克隆抗體的應用研究已在許多的動物實驗中進行。Li等[33]通過對骨質疏松小鼠造模后使用SOST單克隆抗體治療后與對照組相比骨膜及骨質骨形成活動明顯增強，甚至較正常大鼠骨密度更高。目前逐步應用于臨床試驗[34]。

4.3 Dickkopf1

Dickkopf1（Dkk1）在Wnt信號通路中可抑制β-catenin蛋白表達從而抑制成骨細胞分化，并促進成骨細胞凋亡。人類基因學研究發現，Dkk1的基因變化與骨密度的變化存在明顯的相關性。Dkkl通過CRDl與LRP6結合，并抑制Wnt信號通路的激活，Dkkl與LRP6具有很高的親和力。同樣Dkkl可與兩個跨膜蛋白Kremenl/Kremen2結合，Kremen2、Dkkl及LRP6可形成復合物抑制Wnt/LRP信號通道[35]下調去卵巢鼠Dkk1表達會下降NF-κB受體活化因子配體的表達，抑制破骨細胞分化，增加成骨細胞數量，出現骨量增加[36]。因雌激素缺乏引起的骨質疏松癥狀的小鼠，通過干擾RNA和抗Dkk1抗體治療后骨質疏松癥狀可得到明顯改善[37]。Dkk1在骨質疏松靶向治療方面存在著巨大的潛力，應用于臨床治療中可發揮較大作用。

5 總結與展望

Wnt信號通路可通過多層面對骨生長和重建等相關代謝產生影響，與骨質疏松的發生機制密切相關。通過對骨質疏松發生過程中其通路相關蛋白表達的作用機理進行的深入研究，可為骨質疏松癥的治療以及其他骨代謝相關疾病有效治療的研究提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2018-01-04 本文編輯：李岳澤）