生物質(zhì)熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌及保鮮作用

劉芳芳 李范洙 張 先 李 敏

(1. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2. 延邊特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，吉林 延吉 133000)

生物質(zhì)熱解液(簡稱熱解液)是農(nóng)林廢棄物如秸稈、鋸末、雜木等生物質(zhì)在一定條件下快速熱解得到生物油在精制過程中的水溶性組分[1]，其化學組成主要包括有機酸類、酮類、酚類、醇類等化合物[2]，類似于醋液[3]。據(jù)報道木醋液、竹醋液具有促進植物生長、抑制植物病原菌及保鮮的作用[4-5]，相較于其他農(nóng)藥殘留難去除[6]的問題，木醋液毒性小、無殘留，廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其是綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中[7-9]。但對熱解液在抑制植物病原菌和果蔬保鮮方面的研究報道并不多，李金娜等[10]研究了熱解液采前處理對蘋果梨貯藏品質(zhì)的影響，表明熱解液對蘋果梨起到了保鮮作用；張先等[11]研究表明采后熱解液處理對香水梨具有一定的保鮮效果，因此推測熱解液可能對其他果實的貯藏保鮮有一定的作用。甜瓜營養(yǎng)豐富，汁多味甜，備受廣大消費者青睞，中國是世界上最大的甜瓜產(chǎn)區(qū)[12]。甜瓜在生產(chǎn)貯藏及運輸過程中常發(fā)生一些病害，其中甜瓜炭疽菌(Colletorichumorbiculare)是主要病害之一[13]。甜瓜炭疽菌是真菌中的半知菌亞門刺盤孢菌，在甜瓜全生育期都可誘發(fā)炭疽病的發(fā)生，造成甜瓜嚴重腐爛，另外由于采收期集中，且正值高溫季節(jié)，所以甜瓜還存在不耐運輸、貯藏時間短、易軟化等問題[14]。目前農(nóng)民習慣頻繁施用化學藥劑對甜瓜炭疽病進行防治，既增加防治成本，又加重果品污染，防效也不理想[15]，而在保鮮方面中國采用普通冷藏、化學保鮮劑等[16]，均存在效果不佳、化學殘留等問題。另外天然保鮮劑如天然樹脂、殼聚糖、魔芋精粉等涂膜處理雖然能對甜瓜起到保鮮作用，但涂膜必須薄厚均勻，過厚會影響果蔬的呼吸作用，導致生理代謝失調(diào)，引起腐爛變質(zhì)，只能在短期貯藏、運輸或上市前進行處理[17]，且存在風干時間長、占地面積大等不足。而熱解液與上述天然保鮮劑相比于果蔬采前采后均可進行經(jīng)噴灑或浸泡處理，且易風干。根據(jù)熱解液處理蘋果、梨的貯藏品質(zhì)研究試驗可以看出熱解液可以延長貯藏期。因此合理有效開發(fā)天然保鮮劑對甜瓜炭疽病的防治和甜瓜保鮮來說具有重要意義，而目前沒有熱解液對甜瓜保鮮的研究報道。

本試驗擬研究熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌效果及抑菌機理，同時研究熱解液對甜瓜采后貯藏品質(zhì)的影響，以期為開發(fā)低毒無害的果蔬保鮮劑提供一定的理論參考，并為生物質(zhì)資源的綜合利用及熱解液的開發(fā)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

熱解液：2014年廣州迪森集團提供的以木屑為原料，中溫快速熱解法制造的生物油，生物油與水按體積比1∶1混合，在0.1 MPa的真空度下蒸餾，收集100～120 ℃時的蒸餾液；

甜瓜：八里香薄皮甜瓜，延吉市萬源批發(fā)市場。

1.1.2 供試菌種

甜瓜炭疽菌：吉林省蔬菜花卉科學研究院。

1.2 儀器設備

數(shù)顯電導率儀：DDS-11A型，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TMS-PRO型，美國Food Technology Corporation公司；

超微量紫外分光光度計：Q5000型，美國Quawell公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌試驗 用PDA固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃，以10倍間隔對熱解液進行稀釋配制成熱解液濃度為0.9%～3.3%的培養(yǎng)基。用打孔器(直徑為5 mm)在已培養(yǎng)6～8 d的甜瓜炭疽菌平板上選取菌落生長旺盛處制備菌餅，之后將菌絲朝下放入含熱解液的培養(yǎng)平皿中央，以不加熱解液的培養(yǎng)基為對照(CK)，每個培養(yǎng)皿中放置一個菌餅，每個濃度重復3次，24 ℃下培養(yǎng)至對照菌菌落長到平板2/3時用十字交叉法測定菌落直徑，通過抑菌率公式計算不同濃度熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌率[18]。以熱解液濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑菌率的幾率值為縱坐標，得到毒力回歸方程，從毒力回歸方程計算得出熱解液對甜瓜炭疽菌的EC50值和EC70值。

1.3.2 熱解液對甜瓜炭疽菌抑菌機理試驗 用1.4%，1.7%，2.0%，2.5%的熱解液處理甜瓜炭疽菌菌絲后，使用電導率儀進行電導率的測定[19]；參照徐俊光[20]的方法進行細胞蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的測定；蒽酮試劑法測定菌絲總糖含量[21]。

1.3.3 果實品質(zhì)指標的測定

(1) 果肉硬度：用質(zhì)構(gòu)儀測定，參數(shù)為檢測速度30 mm/s，測定深度6 mm，起始力0.5 N[22]。

(2) 可溶性固形物含量：用手持折光儀測定。

(3) 可滴定酸含量：用指示劑滴定法測定[23]。

1.3.4 果實生理生化指標的測定

(1) 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性：采用鄰苯二酚氧化法[24]。

(2) 酚類物質(zhì)含量：福林試劑法[25]。

(3) 多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性：DNS比色法[26]88-89。

(4) 可溶性果膠含量：咔唑比色法[26]90。

1.4 保鮮試驗設計

選取熱解液對甜瓜炭疽菌抑菌試驗中確定的EC50值和EC70值，即濃度為1.8%和2.4%的熱解液對甜瓜浸泡2～3 min 后瀝干，置于室溫，每隔4 d進行相關(guān)指標的測定，并設置對照組(CK)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel計算標準差， 應用SPSS 17.0采用Duncan多重比較法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌作用

熱解液對甜瓜炭疽菌有較好的抑菌效果(圖1)。如表1所示，隨著熱解液濃度的增加，熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌率逐漸增大，當熱解液濃度>2.0%時，抑菌率>50%，且差異顯著(P<0.05)，熱解液濃度為3.3%時抑菌率達到100%。通過不同濃度熱解液對甜瓜炭疽菌抑菌率的測定，求得毒力回歸方程為y=4.064 4X2+2.109 1X+4.106，R2=0.996 7，根據(jù)回歸方程得出熱解液對甜瓜炭疽菌的EC50值為1.8%，EC70值為2.4%。

圖1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌效果Figure 1 Inhibitory effect of bio-liquid on Colletorichum orbiculare表1 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌率?Table 1 The bacteriostasis rate of bio-liquid against Colletorichum orbiculare

%

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 熱解液對甜瓜炭疽菌的抑菌機理

2.2.1 對炭疽菌相對電導率的影響 相對電導率可表示細胞膜通透性，通過測定相對電導率可以看出熱解液是否破壞甜瓜炭疽菌的細胞膜結(jié)構(gòu)。選取對甜瓜炭疽菌抑菌率在30%～80%的不同濃度熱解液對甜瓜炭疽菌進行處理后測定電導率，從圖2可以看出病菌的相對電導率在處理1 h后達到高峰，之后2 h內(nèi)迅速下降，3 h后趨于平緩。1～5 h內(nèi)經(jīng)熱解液處理的病菌的相對電導率隨著處理濃度的增高而增大，各處理組相對電導率均顯著高于對照組，處理1 h后2.5%熱解液處理組相對電導率為56.9%，對照組為30.7%。說明熱解液破壞了甜瓜炭疽菌菌體的細胞膜，造成電解質(zhì)外滲導致電導率升高，而且處理濃度越高，對細胞膜的破壞程度越大。

圖2 熱解液對甜瓜炭疽菌相對電導率的影響Figure 2 Effects of bio-liquid on relative conductivity of Colletorichum orbiculare

2.2.2 對炭疽菌蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的影響 從圖3可以看出，蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的變化趨勢類似，均隨著熱解液處理時間的延長外滲量持續(xù)增加，而且熱解液濃度越大外滲量越多，各處理組的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲量均顯著高于對照組。說明熱解液破壞甜瓜炭疽菌細胞膜結(jié)構(gòu)，導致蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲，且熱解液濃度越大對細胞膜的破壞作用也越大，并且會持續(xù)一定時間。同時在甜瓜炭疽菌剛接觸到熱解液時就有蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲，說明熱解液對甜瓜炭疽菌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞作用迅速。吳慧娟等[27]研究表明神農(nóng)香菊全草精油化學成分主要為萜烯類、醇類和醛酮類，抑菌機制可能在于此等物質(zhì)破壞細菌細胞壁，導致細菌細胞變形和菌體蛋白質(zhì)外滲。付長雪等[28]通過GS-MS對熱解液成分進行了分析，表明熱解液主要組成成分為酸類、胺類、酮類物質(zhì)，還含有少量的醇類、酯類、酚類、醛類物質(zhì)，進一步說明了熱解液的抑菌作用可能與其活性成分有關(guān)。

2.2.3 對炭疽菌菌絲總糖含量的影響 從圖4可以看出，不同濃度熱解液處理甜瓜炭疽菌48 h后，菌絲中總糖含量顯著低于對照組。熱解液濃度越大，菌絲總糖含量越低，其中2.5%熱解液處理組的總糖含量為1.24%，顯著低于其他濃度的。說明熱解液破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，糖類物質(zhì)滲出，導致總糖含量降低，與王海英等[29]對木醋液的研究結(jié)果一致。

2.3 熱解液處理對甜瓜貯藏品質(zhì)的影響

2.3.1 對果肉硬度的影響 由圖5可以看出，在貯藏期間甜 瓜果肉硬度呈下降趨勢，可能是在酶的作用下原果膠被水解生成可溶性果膠，細胞壁的纖維變得松散，果實逐漸變軟，硬度下降[30]。熱解液處理組的果肉硬度較CK組下降緩慢，貯藏8 d起熱解液處理組的硬度顯著大于CK組的，16 d時2.4% 熱解液處理組的硬度顯著大于1.8%熱解液處理組的。說明熱解液處理對甜瓜的硬度下降有保護作用，且熱解液濃度越大，硬度下降越緩慢。可能是熱解液抑制了PG活性，減緩了對果膠的降解，使可溶性果膠的增加受到抑制，進而減緩了果肉硬度的下降。

圖3 熱解液對甜瓜炭疽菌蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的影響

Figure 3 Effects of bio-liquid on protein and nucleic acids extravasation ofColletorichumorbiculare

圖4 熱解液對甜瓜炭疽菌菌絲總糖含量的影響

Figure 4 Effects of bio-liquid on total sugar content ofColletorichumorbiculare

圖5 熱解液對甜瓜果肉硬度的影響Figure 5 Effects of bio-liquid on the pulp’s hardness of muskmelon

2.3.2 對可溶性固形物和可滴定酸含量的影響 可溶性固形物含量直接反映果蔬的成熟程度和品質(zhì)，可作為判斷果品適時采收和耐貯藏性的重要指標，而酸作為果蔬中呼吸作用和能量代謝的底物，可反映出營養(yǎng)物質(zhì)被消耗的程度。由圖6可以看出，隨著貯藏時間的延長，甜瓜果實的可溶性固形物和可滴定酸含量均呈緩慢下降趨勢，且熱解液處理組的下降速度均緩于CK組的。貯藏4 d后熱解液處理組的可溶性固形物含量始終顯著高于CK組的，12 d后2.4% 熱解液處理組的含量始終顯著高于1.8%熱解液處理組的。在整個貯藏過程中熱解液處理組的可滴定酸含量始終顯著高于CK組的，且2.4%熱解液處理組的含量始終顯著高于1.8%熱解液處理組的。因此熱解液處理對甜瓜果實可溶性固形物和可滴定酸含量的下降均有明顯的抑制效果，且熱解液濃度越大抑制效果越明顯。這可能是甜瓜呼吸強度受到抑制從而減緩了對可溶性固形物和可滴定酸的消耗，試驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱解液浸泡處理的甜瓜起初有熱解液的氣味，但不影響甜瓜的香氣，因此推測熱解液會在甜瓜表面形成保護膜，起到抑制呼吸強度的作用。

2.4 熱解液處理對甜瓜生理生化指標的影響

2.4.1 對PPO和PG活性的影響 PPO能催化多種酚類物質(zhì)氧化形成醌類化合物，加速果蔬的衰老進程，降低品質(zhì)[31]102。由圖7(a)可以看出，貯藏期間甜瓜的PPO活性呈上升趨勢，且熱解液處理組的PPO活性上升速度顯著緩于CK組，貯藏8 d后2.4%熱解液處理組PPO活性上升速度顯著緩于1.8%熱解液處理組。說明熱解液處理能夠抑制PPO活性的上升，同樣熱解液濃度越大對PPO活性上升的抑制作用越明顯。

圖6 熱解液對甜瓜可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

Figure 6 Effects of bio-liquid on the content of soluble solid and titratable acid of muskmelon

圖7 熱解液對甜瓜PPO和PG活性的影響Figure 7 Effects of bio-liquid on the PPO and PG activity of muskmelon

PG能夠水解α-(1,4)-半乳聚糖鏈的親水末端，從而導致果膠裂解，加速果實軟化進程[32]。由圖7(b)可以看出，甜瓜果實中PG活性在貯藏前8 d維持一定水平，8 d后迅速上升。貯藏第8 天開始，熱解液處理組的酶活性始終顯著低于CK組的，貯藏12 d起，2.4%熱解液處理組的酶活性顯著低于1.8% 熱解液處理組的。可以看出熱解液對PG活性有明顯的抑制效果，且隨著貯藏時間的延長，熱解液濃度越高對PG活性的影響越大。研究[33]表明PG受乙烯的正向調(diào)控，說明熱解液可能會對乙烯產(chǎn)生抑制作用進而抑制了PG活性。另外熱解液含有一定量的Ca[1]，劉劍鋒[34]研究表明浸Ca處理可以抑制PG酶活性，所以可能也與熱解液中的Ca有關(guān)。

2.4.2 對酚類物質(zhì)和可溶性果膠含量的影響 酚類物質(zhì)是果實中重要的抗氧化物質(zhì)，隨著貯藏時間的延長，酚類物質(zhì)被逐漸消耗。由圖8(a)可以看出，在貯藏0～4 d 時，甜瓜果實中的酚類物質(zhì)有一個緩慢上升的過程之后下降，可能是試驗中甜瓜所處的溫度高于之前貯藏銷售環(huán)境的溫度，導致呼吸強度增大，代謝旺盛，促進了果實內(nèi)部酚類物質(zhì)的合成，使酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢[35]，之后酚類物質(zhì)被消耗逐漸下降。8 d后熱解液處理組的酚類物質(zhì)含量始終顯著高于CK組，且2.4%熱解液處理組酚類物質(zhì)含量始終顯著高于1.8% 熱解液處理組。由此結(jié)果可知，熱解液處理可有效抑

圖8 熱解液對甜瓜酚類物質(zhì)和可溶性果膠含量的影響

Figure 8 Effects of bio-liquid on the phenolic substances and soluble pectin content of muskmelon

制甜瓜貯藏過程中酚類物質(zhì)的消耗，且熱解液濃度越大抑制效果越明顯。熱解液含有多種活性成分，可能和木醋液一樣也具有較強的抗氧化活性[36]，從而減緩了氧化進程，對酚類物質(zhì)的消耗起到了一定的抑制作用。另外試驗結(jié)果表明PPO活性被抑制，從而也對酚類物質(zhì)的消耗起到了延緩作用。

果實在成熟過程中，PG可催化果膠降解，從而使可溶性果膠含量增加，果肉硬度下降，加快果實軟化程度[31]100。由圖8(b)可以看出，甜瓜果實的可溶性果膠含量隨著貯藏時間的延長而逐漸增加，貯藏4 d后，熱解液處理組的可溶性果膠含量顯著低于CK組的，貯藏8 d后2.4%熱解液處理組的可溶性果膠含量顯著低于1.8%熱解液處理組的。因此可以看出熱解液處理后可以明顯抑制可溶性果膠含量的增加，而且熱解液濃度越大抑制效果越明顯。這可能與PG活性受到抑制有關(guān)。

3 結(jié)論

熱解液可以破壞甜瓜炭疽菌的細胞膜結(jié)構(gòu)，使菌絲體中的蛋白質(zhì)、核酸及糖類物質(zhì)外滲，總糖含量降低從而對病菌起到了抑制作用。從甜瓜貯藏過程中果實硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量的變化以及PPO、PG酶活性等生理生化指標可知，熱解液對甜瓜具有良好的保鮮作用。證實了熱解液與醋液一樣具有抑菌及保鮮作用。

熱解液處理能有較好的保鮮效果也可能是熱解液具有較強的抑菌活性，抑制了甜瓜表面腐敗菌的生長，進而對甜瓜保鮮起到了良好的作用，在試驗過程中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱解液處理的甜瓜腐爛率明顯低于對照組。而且隨著貯藏時間的延長，發(fā)現(xiàn)熱解液濃度大，對甜瓜的保鮮效果越明顯，因此對熱解液的保鮮機理需要進一步探究。