樟樹葉多酚抑菌活性及在冷藏草魚肉保鮮中的應用

李應洪 李忠海 付湘晉 張 慧

(中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

中國樟樹資源豐富，目前主要是用于綠化、木料加工及提取芳樟油，大量加工下腳料(枝、葉)未被利用。樟樹葉含有大量酚類物質，是新的多酚資源[1-2]。多酚對多種細菌、真菌、酵母菌有明顯的抑制作用。Singh等[3]發現肯氏蒲桃多酚對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯氏肺炎菌、佛里德蘭德氏桿菌、白色念珠菌顯示了較好的廣譜抗菌效果，抑菌直徑為14.3～23.0 mm，最小抑菌濃度為0.5～2.5 mg/mL。Aziz Shahid等[4]從紅花百里香中分離出酚類化合物，其中迷跌香酸對化膿性鏈球菌顯出很好的抗菌活性。棗漿中多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度分別為(MIC)30，20 mg/mL[5-6]。這些結果表明，多酚提取物作為天然抑菌劑在食品保鮮領域具有潛在的研究和開發價值。已有研究[7-8]報道，樟樹葉多酚具有優良的抗氧化活性，但其抗菌活性還未見報道。

本試驗擬研究樟樹葉多酚對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、黑曲霉、大腸埃希菌、熒光假單胞菌等7株常見致病菌、腐敗菌的抑菌活性，以及其對草魚肉的保鮮作用，為開發天然抗菌保鮮劑提供參考，也為樟樹葉高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樟樹葉多酚提取物：本實驗室自制[2,9-10];

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、青霉、毛霉：由中南林業科技大學食品科學與工程學院提供；

草魚：2～3 kg/尾，鮮活，市售。

1.2 方法

1.2.1 多酚對試驗菌株的抑菌作用 根據參考文獻[11]，采用試管法測定最低抑菌濃度(MIC)，采用平皿法測定最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.2 樟樹葉多酚對草魚片的保鮮作用 分別取5，10 g 樟樹葉多酚定容至100 mL，得濃度分別為50，100 mg/mL的樟樹葉多酚保鮮液。

鮮活草魚宰殺后，去頭、去尾、去內臟，清洗，切成3 cm×3 cm的魚塊，30 min內進行樟樹葉多酚涂抹處理完畢，冷藏于4 ℃冰箱，使魚肉中多酚濃度達到5，10 μL/g。

1.2.3 魚片菌落總數測定 按GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數的測定》執行。樣品的菌落計數選擇營養瓊脂培養基，30 ℃培養72 h。

1.2.4 魚片pH的測定 取絞碎的草魚魚肉5.0 g于燒杯中，加入45 mL去CO2的蒸餾水，攪拌、浸漬30 min，過濾靜置后用pH計測其上清液pH值[12]。

1.2.5 魚片揮發性鹽基氮(TVB-N)值的測定 根據文獻[12]，采用半微量定氮法測定。

1.2.6 魚片TMA值的測定 采用苦味酸法測定[12]。

1.3 數據處理

試驗數據均采用3次平行試驗的平均值，使用SPSS 13.0 進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 樟樹葉多酚最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)

本試驗選取了常見食品腐敗菌或致病菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、大腸埃希菌、青霉、黑曲霉、毛霉7株微生物進行研究，結果見表1。從表1可以看出，樟樹葉多酚對試驗菌株均有明顯抑制作用，與文獻[5]報道中其它植物多酚基本一致。樟樹葉多酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉等均有明顯抑制作用，抑制效果順序為：熒光假單胞菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌=大腸埃希菌>青霉=黑曲霉=毛霉，最小抑菌濃度分別為0.500，0.625，1.250，2.500 mg/mL。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是草魚冷藏過程中最主要的腐敗菌[13-14]；樟樹葉多酚對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度只有0.500 mg/mL，最小殺菌濃度為1.000 mg/mL；所以可以預計，樟樹葉多酚可作為靶向抑菌劑用于草魚保鮮。

2.2 樟樹葉多酚對草魚魚片的保鮮效果

因為樟樹葉多酚對草魚冷藏過程中最主要的腐敗菌[13-14]熒光假單胞菌有明顯抑制作用；所以，進一步研究了樟樹葉多酚對冷藏草魚魚片的保鮮效果。測定了樟樹葉多酚對冷藏過程草魚片中細菌總數、pH、TVB-N、TMA的影響，結果分別見圖1～4。

表1樟樹葉多酚的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度

Table 1 The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of camphor tree leaves’ polyphenol

mg/mL

2.2.1 對冷藏草魚魚片菌落總數的影響 菌落總數測定結果(圖1)表明，樟樹葉多酚處理明顯改變了魚片中菌落總數的變化趨勢，空白樣品菌落總數一直快速增加，但樟樹葉多酚處理魚肉在貯藏初期菌落總數增長緩慢，有一個明顯的延滯期，5，10 mg/g樟樹葉多酚添加量魚片的延滯期分別是2，4 d；表明樟樹葉多酚能有效抑制魚肉中微生物的繁殖、生長。以魚肉菌落總數超過6 lg CFU/g為限值[12]；空白對照魚片菌落總數4 d即超過6 lg CFU/g；5，10 mg/g樟樹葉多酚添加量魚片分別在第6、9天超過6 lg CFU/g，所以，樟樹葉多酚可延長魚肉冷藏貨架期。

圖1 樟樹葉多酚對冷藏草魚菌落總數的影響Figure 1 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the colony count of Grass carp

2.2.2 對冷藏草魚魚片pH值的影響 由圖2可知，魚片初始pH值約6.50，空白對照魚片pH值一直緩慢增加；樟樹葉多酚處理明顯改變了魚片pH值變化趨勢，貯藏初期(2 d內)，pH值有一降低的過程，此后才緩慢升高，與茶多酚保鮮的草魚肉pH值變化趨勢一致[15]。魚肉pH值的變化與魚體自身酶的作用及微生物繁殖有關。pH值降低是因為魚肉中糖類酵解產生乳酸，ATP和磷酸肌酸分解產生磷酸，pH值上升主要是由于貯藏過程中微生物利用魚肉中的蛋白質大量生長繁殖，產生TVB-N和TMA等堿性含氮物質。所以，魚肉pH值上升，間接反映了此期間魚肉中微生物的大量積累和繁殖。樟樹葉多酚延緩了冷藏魚肉pH值上升，間接表明樟樹葉多酚對魚體微生物的繁殖、生長有抑制作用。

圖2 樟樹葉多酚對冷藏草魚片pH的影響Figure 2 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the pH of Grass carp

2.2.3 對冷藏草魚魚片揮發性鹽基氮(TVB-N)的影響 揮發性鹽基氮(TVB-N)是評價肉制品鮮度的主要衛生指標，TVB-N的增加主要是因為蛋白質在細菌的繁殖和內源性酶的作用下，分解產生的氨及胺類等堿性含氮物質；TVB-N含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，肉制品的腐敗程度越嚴重。不同種類魚肉的TVB-N含量可接受的上限不同[16]。周然等[17]的研究中指出鱈魚魚肉中TVB-N含量的可接受上限為60 mg/100 g，黑鱸的可接受上限為10 mg/100 g，鰱魚的可接受上限為35～40 mg/100 g。楊輝等[16]在草魚肉保鮮研究中，確定草魚TVB-N值在17 mg/100 g以下為新鮮水平。

圖3表明，在貯藏前期，魚肉的TVB-N值增長緩慢，隨著貯藏時間的延長，魚體TVB-N值的增長速度明顯高于貯藏前期，主要是因為微生物大量繁殖，氨基酸被破壞，造成揮發性含氮物質大量生成，使得魚肉的TVB-N值急劇上升。樟樹葉多酚處理明顯降低了魚肉TVB-N含量的升高速度，特別是在貯藏前期，5，10 mg/g樟樹葉多酚添加量的魚肉在冷藏開始的2，4 d，其TVB-N含量升高很少，因為樟樹葉多酚處理抑制了微生物的生長繁殖，所以TVB-N增加的速度明顯降低。以TVB-N含量17 mg/100 g為限量值，則5，10 mg/g 樟樹葉多酚處理可使魚片貨架期從3 d分別延長至6，8 d。

2.2.4 對冷藏草魚魚片三甲胺(TMA)的影響 TMA有明顯的魚惡臭味，由氧化三甲胺在腐敗細菌的氧化三甲胺還原酶的作用下產生。TMA也是評價魚肉鮮度的重要衛生指標，TMA含量越高，其鮮度越差。圖4表明，樟樹葉多酚處理明顯延緩了TMA升高的速度；對照樣品從貯藏開始，TMA值即呈明顯上升趨勢，2 d后加速上升；樟樹葉多酚處理魚片樣品在貯藏期前6 d，TMA值均只有緩慢升高。

圖3 樟樹葉多酚對冷藏草魚TVB-N含量的影響Figure 3 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the TVB-N of Grass carp

圖4 樟樹葉多酚對冷藏草魚片TMA的影響Figure 4 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the TMA of Grass carp

3 結論

樟樹葉多酚對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉均有明顯抑制作用；特別對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度只有0.500 mg/mL，最小殺菌濃度為1.000 mg/mL。樟樹葉多酚5，10 mg/g處理可分別使冷藏魚片貨架期從3 d延長至6，8 d；樟樹葉多酚可作為魚肉靶向抑菌劑，具有進一步研究和開發價值。但樟樹葉多酚的單體組成及其抑菌機制還需進一步研究。