蓮子低聚糖超聲波—微波輔助提取工藝優化

郭澤鑌 陳竟豪 賈祥澤 盧 旭 鄭寶東

(1. 福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002;2. 福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002)

蓮(NelumbonuciferaGaertn.)廣泛分布于中國福建、江蘇、湖北、江西等南方各省。有研究[1]表明，小鼠口服蓮子發酵乳后，其結腸運動加快且腸道糞便停留時間減少，表明發酵乳中含有多種與棉子糖類似的糖類物質。這是由于蓮子中富含生物活性低聚糖-蓮子低聚糖(Lotus seed oligosaccharides, LOS)，其主要成分為二、三、四糖，各單體結構中糖苷鍵連接方式為Manp-1→Galp-1→α(1→6)-Glcp和α(1→6)-Manp。此外，蓮子低聚糖還可以促進青春雙歧桿菌中乙酸、丙酸、丁酸以及消化酶的產生。功能性低聚糖很早就作為腸道功能調節劑食用[2]，因而蓮子低聚糖對于促進腸道健康具有重要意義[3]。

在食品領域結合現代高新技術進行生物活性物質提取一直為研究熱點，其中微波加熱提取技術(Microwave-assisted extraction, MAE)已大量應用于藥物活性產物萃取研究，在常壓條件下，微波技術耗能更低并具有較佳的萃取效果。與微波技術相比超聲提取(Ultrasonic-assisted extraction, UAE)更有效率，能提高傳質質量和多孔溶劑滲透能力。因此，它可以釋放細胞內不溶性物質，減少提取時間，并在較低溫度下增加產量[4]。此外，超聲輔助萃取不受溶劑、基質或水分含量的限制，應用性更為廣泛[5]。超聲波—微波協同提取(Ultrasonic microwave-assisted extraction, UMAE)技術彌補了前2種技術存在的不足，目前，UMAE已被應用于植物中提取多種活性化合物，如番茄紅素[6]、植物油[7]和多糖[8]等，但未見其應用于蓮子低聚糖提取的研究報道。

本試驗擬應用超聲波—微波協同技術從蓮子中提取低聚糖，通過響應面試驗優化提取工藝參數，并與其他提取方法進行比較,以期保留高得率的同時降低成本，為蓮子的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮的干蓮：福建綠田食品有限公司；

氯仿、異戊醇、硫酸、95%濃度乙醇、苯酚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

電動勻漿機：DY89-1型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

低速臺式離心機：TDL-5型，上海安亭科學儀器廠；

循環超聲波處理機：CTXNW-2B型，北京弘祥隆生物技術股份有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2550型，日本島津技術有限公司；

微波萃取儀：MAS-Ⅱ型，上海新儀微波化學科技有限公司；

旋轉蒸發器：BUCHI 409型，美國Buchi公司；

冷凍干燥機：MCFD5505型，美國SIM公司；

鼓風干燥箱：DHG-9030型，北京Tayasaf公司；

植物粉碎機：FW-80型，天津Taisite公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮子低聚糖浸提試驗 將速凍鮮蓮解凍1 h后，在50 ℃ 干燥箱中干燥，控制含水量7%左右。將干燥的蓮子用高速粉碎機粉碎，篩分通過60目(孔徑0.3 mm)備用。將干蓮子粉和去離子水以1∶5 (g/mL)混合。按照Guo等[9]的方法去除蓮子中的淀粉，以排除超聲降解淀粉對低聚糖產量的影響。處理后樣品分別進行超聲波和微波處理(超聲波處理功率為300 W)，隨后將濾液進行快速真空濃縮，并將5倍濾液體積95%乙醇加入濾液中，在4 ℃下離心20 min后，取上清液冷凍干燥48 h，收集備用[10]。

1.3.2 蓮子低聚糖組分分析 將1.3.2中獲取的粉末與純水混合后使用容量瓶定容至100 mL；取1 mL樣品使用微孔膜過濾(0.22 μm)，自動進樣至高效液相色譜(Agilent 1200)定量分析。色譜參數為：20 μL樣品量，Agilent Hi-plex Na (Octo) 高效液相色譜柱(300 mm×7.7 mm，填料粒徑8 μm)，流動相為屈臣氏蒸餾水，柱溫85 ℃，流速0.6 mL/min。

1.3.3 響應面試驗設計 綜合前期單因素預試驗的結果，選取超聲波時間、超聲溫度、微波功率、微波時間和液料比5個因素為自變量，因變量為蓮子低聚糖得率，根據中心組合設計原理選用N=46的Box-behnken為試驗次數，其中因素水平編碼見表1。

1.3.4 低聚糖得率測定 采用苯酚硫酸法[11]。以葡萄糖溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標，葡萄糖吸光度A為縱坐標，葡萄糖標準曲線：A=0.007 2C-0.003 3，R2=0.998 4。低聚糖得率按式(1)計算：

表1 Box-behnken試驗因素及編碼水平表

Table 1 The levels of variables employed in the present study for the construction of the Box-behnken Design

編碼水平X1超聲時間/minX2超聲溫度/℃X3微波功率/WX4微波時間/minX5液料比(mL/g)-1104510060300205520080551306530010080

(1)

式中：

Z——蓮子低聚糖得率，%；

C——換算的葡萄糖溶液濃度，μg/mL；

N——測量時稀釋倍數；

m——蓮子干重質量，g。

1.3.5 浸取前后蓮子粉末形態觀察 分別取不同提取方法提取后的蓮子粉末樣品適量，使樣品牢固地附著于樣品臺上，置于真空噴鍍儀,在樣品表面鍍導電層鉑，厚度10 nm，采用掃描電鏡觀察，電子槍加速電壓為5 keV。

1.3.6 統計分析 所有試驗均設置平行樣品并重復3次，結果用平均值表示；采用SAS (version 9.1, SAS Institute., Cary, NC, USA)進行試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 模型構建及參數分析

提取蓮子低聚糖的Box-behnken試驗設計方法及結果見表2。利用SAS軟件對試驗測試結果進行多元回歸擬合，可得各個單因素對蓮子低聚糖得率的二元多項式回歸模型方程為：

(2)

由表4可知，超聲的時間(X1)、溫度(X2)與微波時間(X4)對蓮子中低聚糖得率的影響皆極顯著(P<0.01)，可能與處理的先后順序有關，超聲波對蓮子植物細胞的影響強于微波效應；微波功率(X3)與液料比(X5)對其得率的影響皆不顯著(P>0.05)，表明微波功率作用可能對最終得率的影響不大。

表2 Box-behnken試驗設計及低聚糖得率實測值Table 2 Box-behnken Design and actual values of LOS yield

表3回歸模型的方差分析

Table 3 Analysis of variance (ANOVA) testing the fitness of the regression equation

變異來源平方和自由度均方F值P值模型 185.176 8209.258 827.947 2<0.000 1殘差 8.282 4250.331 3失擬項7.533 4200.376 72.514 20.155 5誤差 0.749 150.149 8總和 193.459 345

2.2 響應面分析

由圖1(a)與圖2(a)可得，當超聲溫度固定時，低聚糖得率隨超聲時間的延長表現為先減小再增大的趨勢；當超聲時間水平固定時，低聚糖得率隨超聲波溫度的增加呈減小的趨勢。由此可得，在超聲波溫度為45～50 ℃，超聲波時間為10～12 min時低聚糖得率有極大值。

由圖1(b)與圖2(b)可得，當超聲時間固定時，低聚糖得率隨微波功率的增大無明顯變化；當微波功率水平固定時，低聚糖得率隨超聲波時間的延長表現為先增加后降低的趨勢。由此可得，當微波功率為100～150 W，超聲波時間為10～11 min時低聚糖得率有極大值。這可能與微波能量對植物材料的離子傳導和偶極旋轉效應有關。

由圖1(c)與圖2(c)可得，當超聲時間固定時，低聚糖得率隨超聲時間的延長表現為逐漸增加的趨勢；當微波時間水平固定時，低聚糖得率隨超聲波時間的延長表現為先增加后下降再增加的趨勢。由此可得，當超聲波時間為10～11 min，微波時間為95～100 min時低聚糖得率有極大值。提取時間是影響產量的重要因素，初始階段溶劑在提取初期吸收微波能量，提高溶劑溫度。這種變化加速了低聚糖在植物細胞中的溶解，促進了其進入溶劑。隨著提取時間的延長，較高的溫度將加速分子運動，改變提取溶劑和植物的電導率[14]。另一方面溶劑溫度提高了超聲波的空化效應，促進了空化細胞核的形成，導致植物細胞表面受損，從而促進溶劑滲入植物細胞[15]。這2種效應加速了低聚糖在萃取溶劑中的擴散，提高得率。

由圖1(d)與圖2(d)可得，當超聲時間固定時，低聚糖得率隨液料比增大并無明顯變化；當液料比水平固定時，低聚糖得率隨超聲波時間的延長表現為先增加后降低再上升的趨勢。由此可得，當超聲波時間為10～11 min，液料比為30.00～40.00 (mL/g)時低聚糖得率有極大值。

表4 回歸方程系數的顯著性檢驗Table 4 Testing of the significance of the regression coefficients

由圖1(e)與圖2(e)可得，當超聲溫度固定時，低聚糖得率會隨著微波功率增大表現為先增加后減小的趨勢；當微波功率水平固定時，低聚糖得率隨超聲波溫度的增大表現為逐漸減小的趨勢。由此可得，當超聲波溫度為45～47 ℃，微波功率為100～300 W時低聚糖得率有極大值。

由圖1(f)與圖2(f)可得，當超聲溫度固定時，低聚糖得率隨微波時間的延長表現為逐漸增加的趨勢；當微波時間水平固定時，低聚糖得率隨超聲波溫度的增大表現為逐漸減小的趨勢。由此可得，當超聲波溫度為45～50 ℃，微波時間為76～100 min時低聚糖得率有極大值。

由圖1(g)與圖2(g)可得，當超聲溫度固定時，低聚糖得率隨液料比增大表現為輕微增加隨后減小的趨勢；當液料比水平固定時，低聚糖得率隨超聲波溫度的增大表現為逐漸減小的趨勢。由此可得，當超聲波溫度為45～47 ℃，液料比為30.00～80.00 (mL/g)時低聚糖得率有極大值。

由圖1(h)與圖2(h)可得，當微波功率固定時，低聚糖得率隨微波時間的延長表現為輕微增加的趨勢；當微波時間水平固定時，低聚糖得率隨微波功率的增大并無明顯變化。由此可得，當微波功率為100～300 W，微波時間為92～100 min 時低聚糖得率有極大值。

由圖1(i)與圖2(i)可得，當微波功率固定時，低聚糖得率隨液料比的增大表現為先減小后增加的趨勢；當液料比水平固定時，低聚糖得率隨微波功率的增大表現為輕微的先減小后增加的趨勢。由此可得，當微波功率為250～300 W，液料比為為30.00～35.00 (mL/g)時低聚糖得率有極大值。

由圖1(j)與圖2(j)可得，當微波時間固定時，低聚糖得率隨液料比的增大表現為逐漸減小的趨勢；當液料比水平固定時，低聚糖得率隨微波時間的延長表現為逐漸增加的趨勢。由此可得，當微波時間為92～100 min，液料比為75～80 (mL/g) 時低聚糖得率有極大值。

2.3 參數優化及模型驗證

采用響應曲面擬合并在單因素最優范圍內以蓮子低聚糖得率最大為優化目的，對試驗數據進行分析，得到超聲波微波聯合提取的最佳條件為：超聲波時間10.16 min、超聲溫度45 ℃、微波功率100.1 W、微波時間100 min、液料比30.00∶1 (mL/g)，此條件下預測低聚糖得率為10.749 3%。為充分考慮實際試驗儀器操作的可行性和所得模型對應預測結果的準確性，將實際操作參數修正為：超聲波時間10 min、超聲溫度45 ℃、微波功率100 W、微波時間100 min、液料比30.00∶1 (mL/g)，以此條件進行實際參數的驗證實驗，經3次平行實驗后可得蓮子低聚糖得率為(10.525±0.017)%，預測值與實際值偏差不大，由此表明響應面回歸方程能較好地模擬試驗過程和預測蓮子低聚糖得率，并真實地反映超聲微波聯合提取對低聚糖得率的影響。

圖1 交互作用對低聚糖得率影響的響應面圖Figure 1 Response surface diagram of the effect of interactions on LSO yield

圖2 交互作用對低聚糖得率影響的等高線圖Figure 2 Contour plots of the effect of interactions on LSO yield

2.4 蓮子低聚糖組分分析

由圖3對照可知，經過超聲波-微波協同提取的蓮子低聚糖由3個組分LSO1、LSO2和LSO3組成，各組分分離度良好，其保留時間分別為7.019，7.672，8.885 min，而水蘇糖、棉籽糖、蔗糖保留時間分別為7.054，7.636，8.654 min。LSO1、LSO2和LSO3與水蘇糖、棉籽糖、蔗糖保留時間幾乎相同，由此可知，LSO1到LSO3分子質量依次減小，各組分聚合度為2～4。

1. 水蘇糖 2. 棉籽糖 3. 蔗糖 4. LSO1 5. LSO2 6. LSO3圖3 標準品與蓮子低聚糖高效液相色譜圖

Figure 3 High performance liquid chromatography of standard and lotus seed oligosaccharides

2.5 低聚糖提取方法對比試驗

本試驗利用超聲波—微波提取低聚糖得到低聚糖實際得率為(10.525±0.017)%，與熱水浸提低聚糖得率8.09%[16]以及超聲波輔助提取低聚糖實際得率為(1.13±0.026)%[11]相比，超聲波—微波聯合提取低聚糖能顯著提高蓮子低聚糖的得率。宋春麗等[17]的研究同樣認為超聲波-微波輔助提取低聚糖具有很好的效果，這是由于在處理樣品時，超聲波首先對蓮子內細胞質產生機械振動作用，破壞了細胞壁的穩定結構。而微波處理更容易使微波能量穿透細胞壁從而為蓮子細胞內極性溶液吸收并由內部首先產生熱效應，導致胞內壓力增大，細胞壁破裂，使低聚糖溶出，2種處理的協同作用極大地提升了蓮子低聚糖的提取效率[18-19]。綜上所述，超聲波—微波輔助提取法不僅可提高低聚糖得率和提取效率、實現低溫提取并達到能耗減少的環保效果，其對所提取的生物活性物質的結構和功能影響較小，產物具有較高的生物活性[20]。

2.6 電鏡分析

在圖4(a)中可以觀測到一些粒徑在10～20 μm的橢球狀顆粒物質，為細胞破壞后殘余的蓮子淀粉顆粒。體系中同時存在著大量無規則的膜狀物質，很可能是蓮子細胞在處理過程中破碎，細胞液流失后殘存下的細胞壁、膜、器膜等物質。說明不同提取方法都對蓮子細胞產生了破壞作用。

由圖4可以看出，超聲波—微波輔助提取法對蓮子細胞的破壞程度最大，細胞壁等膜狀結構破損程度更高，產生了較多細小的碎片。出現該現象可能是在超聲波—微波聯合提取法提取時，細胞內液由于微波作用產生熱效應引起細胞膨脹，導致細胞漲破后其中的內容物被釋放出來。此外超聲波對蓮子細胞液產生了較強的機械振動作用，破壞了細胞壁的穩定結構，加速了膜結構的分解[21]。另一方面，水分子可以有效吸收微波能量，有效地加熱樣品[22]。因此通過微波超聲波使蓮子細胞獲得了劇烈的膨脹和細胞壁的破裂，允許化合物釋放到溶劑中。這些結果與以往研究結果一致[23]，SEM分析提供了微波超聲波作用下高低聚糖提取效率的有力證據。

圖4 不同方法提取后蓮子粉末的環境掃描電鏡圖

Figure 4 The micrographs of samples (after different extractions) by environmental scanning electron microscopy

3 結論

本研究采用響應面分析并結合中心組合試驗設計法優化了蓮子低聚糖超聲波—微波聯合提取工藝參數，構建超聲時間與溫度、微波時間與溫度和液料比對低聚糖得率的二次多項式回歸模型。確定最優的提取工藝參數為：超聲波時間10 min、超聲溫度45 ℃、微波功率100 W、微波時間100 min、液料比30∶1 (mL/g)，在該條件下低聚糖得率為10.525%。超聲波—微波協同提取的蓮子低聚糖由LSO1、LSO2和LSO3組成，LSO1到LSO3分子質量依次減小，各組分聚合度為2～4。超聲波—微波聯合提取相比單獨熱水和超聲波提取能顯著提高蓮子低聚糖的得率，這與兩者作用加速細胞膜結構的分解和水分子可以有效吸收微波能量有關。該技術可用于蓮子低聚糖的高效提取，可作為功能食品等增值產品的新型原料。后期將從益菌和結構角度對提取的蓮子低聚糖進行深入分析。