竹柏果油提取工藝優化及理化特性分析

呂露露 楊崇文 李承勇, 孫省利, 閆協民 蘇添添 馮彥婷

(1. 廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088;2. 湛江市海岸帶生態工程技術研究開發中心，廣東 湛江 524088)

人體血清中總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇含量過高易誘發冠心病和腦梗死[1]。研究[2-3]發現，不飽和脂肪酸可參與膽固醇酯化過程，提高不飽和脂肪酸的攝入量可降低血清中膽固醇的含量。為此，尋找自然界中優質不飽和脂肪酸的來源，尤其是具有顯著生物活性的長鏈不飽和脂肪酸(C20以上)已成為科研人員關注的熱點[4]。然而由于漁業資源日益減少，有效成分及純度符合要求的長鏈不飽和酸原料十分有限(主要集中于沙丁魚、三文魚、金槍魚等深海魚類)，再加上提純工藝繁瑣復雜等問題使得開發成本較高。雖然植物油脂提純工藝相對簡單且成本可觀，但其脂肪酸組成中長鏈不飽和脂肪酸的比例一般較低。

竹柏(Podocarpusnagi)為羅漢松科(Podocarpacese)羅漢松屬植物，是古老的裸子植物，起源于中生代白堊紀，被人們稱為“活化石”[5]。竹柏作為常綠喬木，在中國主要分布于華南地區、臺灣和云南南部，越南、柬埔寨也有分布[6]。竹柏根莖及枝葉中含有多種活性成分，包括黃酮、環肽及二萜類化合物等，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，為各地植物志所記載[7]。竹柏經種子繁殖后10年左右可開花結果，其果仁含油量較高。有數據顯示，竹柏盛果期單株產果高，種子含油量可達30%[8]，但其脂肪酸的含量及成分還尚不明確。目前關于竹柏的研究主要集中在葉子和枝干等方面，謝黛等[9]在竹柏葉中提取出了黃酮物質，而劉娟等[10]對長葉竹柏的葉子和枝干的化學成分進行了分離與鑒定。但對于竹柏果實成分和應用的研究還未有報道。本試驗擬以成熟的竹柏果為原料，對超聲波輔助索氏抽提竹柏果油的工藝進行優化，并研究該油脂的基本理化性質及脂肪酸組成，為提取不飽和脂肪酸尤其是長鏈不飽和脂肪酸提供更多的來源，并為后期竹柏果實中竹柏果油的提取純化工藝和竹柏資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

竹柏果：廉江市某種植基地，經曬干于-20 ℃冰箱儲存，使用前去皮、殼，取其果仁；

所用試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，金壇市醫療儀器廠；

超聲波清洗機：JP-040S型，深圳市潔盟清潔設備有限公司；

萬分之一電子天平：BSA224S-CW型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

超純水一體機：D24-UV型，默克密理博試驗室設備(上海)有限公司；

臺式高速大容量冷凍離心機：5810R型，艾本德中國有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-O(Ⅲ) 型，鞏義市予華儀器有限公司；

旋轉蒸發器：RE-3000B型，鞏義市予華儀器設備工貿有限公司；

冷凝水泵：CCA-20型，鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將竹柏果仁經超純水充分清洗后先于60 ℃ 烘箱中干燥待其自然冷卻后研磨備用。

1.2.2 基本成分和理化指標測定

(1) 粗蛋白：參照文獻[11]。

(2) 粗脂肪：參照文獻[12]。

(3) 灰分：參照文獻[13]。

(4) 酸值、過氧化值、水分及揮發物、碘值和皂化值：按GB/T 5528—2008系列方法執行。

1.2.3 提取率的測定 稱取4.0 g經研磨的竹柏果仁，用濾紙包裹好置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶40 (g/mL)加入正己烷，用超聲波清洗機(功率：240 W，溫度：25 ℃)超聲6 min 后，將樣品濾紙包放入抽提筒中，將提取溶劑倒進250 mL 平底燒瓶中，于75 ℃水浴加熱，回流150 min。提取結束后將提取液過濾，濾液經減壓蒸餾、干燥、恒重，按式(1)計算竹柏果仁油提取率。

(1)

式中：

R——竹柏果油提取率，%；

m1——竹柏果仁油質量，g；

m2——竹柏果仁粉質量，g。

1.2.4 竹柏果油提取工藝優化

(1) 提取溶劑的選擇：固定超聲時間6 min，提取溫度75 ℃，提取時間150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察正己烷、石油醚、乙酸乙酯對竹柏果油得率的影響。

(2) 超聲時間的選擇：固定提取溶劑為正己烷，提取溫度75 ℃，提取時間150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察不同超聲時間(2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 min)對竹柏果油得率的影響。

(3) 提取溫度的選擇：固定提取溶劑為正己烷，超聲時間6 min，提取時間150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察不同提取溫度(60，65，70，75，80，85，90 ℃)對竹柏果油得率的影響。

(4) 提取時間的選擇：固定提取溶劑為正己烷，超聲時間6 min，提取溫度75 ℃，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察不同提取時間(60，90，120，150，180，210，240 min)對竹柏果油得率的影響。

(5) 料液比的選擇：固定提取溶劑為正己烷，提取溫度75 ℃，提取時間150 min，超聲時間6 min，分別考察不同料液比[1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100，1∶110 (g/mL)]對竹柏果油得率的影響。

1.2.5 響應面優化竹柏果油提取工藝 以單因素結果為基礎，選取提取溫度、回流時間、料液比3個因素設計正交試驗，每個因素設置3個水平，對提取條件進行優化。

1.2.6 脂肪酸組成分析

(1) 甲酯化：取竹柏果油20 mg于50 mL平底燒瓶中，加入2 mL正己烷充分渦旋溶解后，再加入2% 氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL混勻，置于60 ℃水浴鍋加熱，直至液面上的油滴消失，加入濃度為16%的三氟化硼溶液2 mL，加熱15 min，冷卻至室溫，轉入50 mL比色管中，用飽和氯化鈉溶液清洗平底燒瓶，并轉入比色管中，振蕩1～2 min，靜置10 min，取比色管中上清液過0.2 μm微孔濾膜到進樣瓶，作為GC-MS分析試樣[14]。

(2) GC-MS分析：載氣是高純氮氣；色譜柱初始溫度為50 ℃，恒溫0.5 min后，以55 ℃/min升至155 ℃，再以8 ℃/min 升至175 ℃，然后以1.2 ℃/min升至187 ℃，最后以9 ℃/min升至280 ℃[15]；色譜柱為HP-530 m×0.25 mm×0.25 μm彈性石英毛細管柱[16]。進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL；分流比100∶1；掃描模式SCAN，SIM；He流速45 cm/s。

(3) 定量分析：將100 mg混合標準樣品用正己烷溶解，并定容至2 mL得濃度為50 mg/mL，再用正己烷分別稀釋至40.0，25.0，10.0，5.0，2.0，0.6 mg/mL系列的標準溶液，然后用GC-MS/SIM對其進行分析，以峰面積和質量濃度作定量工作曲線。使用相同的GC-MS操作條件和過程來分析竹柏果仁油試樣，并基于定量離子的響應值和建立的標準曲線進行絕對定量[17]。

1.2.7 數據處理 采用Origin 8.5、SPSS 19.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑對竹柏果油得率的影響 由圖1可知，乙酸乙酯提取率最高，與石油醚相比差異不明顯(P>0.05)，與正己烷相比差異顯著(P<0.05)。乙酸乙酯提取油量最大的原因，可能與乙酸乙酯的極性較大有關，也可能是竹柏果仁油以不飽和脂肪酸為主，其中的不飽和雙鍵能與乙酸乙酯反應形成新的價鍵，并且加入乙酸乙酯后，油脂的初始運動黏度降低[18]，有助于油脂在乙酸乙酯中的溶解。這兩方面的原因使乙酸乙酯對竹柏果仁油的提取率最高。提取溶劑對得油率有很大的影響，合適的提取溶劑不僅能使油料細胞在超聲情況下發生破碎，還能使油料中的有效成分充分溶出。由于乙酸乙酯價格較高，并且可能造成油樣成分損失，石油醚的毒性較高，危險性大。因此綜合考慮提取效果、經濟成本和安全問題，選用正己烷為提取溶劑進行后續試驗。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 溶劑對竹柏果出油率的影響Figure 1 Effect of different solvents on the oil yield rate of Podocarpus nagi

2.1.2 超聲時間對竹柏果油得率的影響 由圖2可知，超聲時間6 min前，竹柏果油提取率隨著時間的延長而增加，在6～12 min時竹柏果油的提取率變化較為平緩，差異不顯著，在14 min時出現上升趨勢后又趨于平緩，甚至低于6 min的提取率，可能是超聲加速了正己烷的揮發所致。同時，長時間超聲，能量消耗較大。因此，選擇超聲時間為6 min 進行后續研究。

2.1.3 提取溫度對竹柏果油得率的影響 由圖3可知，溫度低于70 ℃，竹柏果油提取率隨著提取溫度的上升而增加，溫度的上升會促進溶劑對物料的滲透；在70～85 ℃時提取率的變化趨于穩定；而高于85 ℃，提取率逐漸下降，可能是溫度過高，溶劑的蒸發速度加快，對樣品的浸提時間減少，使得提取率下降。因此，最終選定65～75 ℃進行響應面優化試驗。

2.1.4 提取時間對竹柏果油得率的影響 由圖4可知，提取時間在150 min以前隨著提取時間的延長，竹柏果油的提取率增長較快，超過150 min后，提取率變化不顯著。為此應選擇150 min為響應面優化試驗的中心點。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖2 超聲時間對竹柏果出油率的影響Figure 2 Effect of change of ultrasonic time on the oil yield rate Podocarpus nagi

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 提取溫度對竹柏果出油率的影響

Figure 3 Effect of change of extraction temperature on the oil yield rate ofPodocarpusnagi

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 提取時間對竹柏果出油率的影響

Figure 4 Effect of change of extraction time on the oil yield rate ofPodocarpusnagi

2.1.5 料液比對竹柏果油得率的影響 由圖5可知，隨著提取劑的增加，反應體系的滲透壓越大，竹柏果油在溶劑中的擴散速度也會提高，提取率隨之上升。當料液比超過1∶40 (g/mL)后，竹柏果油提取率的增加不明顯，趨于平緩。進一步增加提取劑會增加提取成本。因此，選擇料液比1∶40 (g/mL)為響應面試驗的中心點。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖5 料液比對竹柏果出油率的影響Figure 5 Effect of change of liquid ratio on the oil yield rate of Podocarpus nagi

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗方案設計及結果分析 以竹柏果仁油提取率(R)為響應值，選擇提取溫度、提取時間、料液比3個因素設計正交試驗，每個因素設置3個水平，進一步優化提取條件，試驗因素與水平見表1，試驗設計及結果見表2。

使用Design expert 8.0.6軟件對模型列回歸方程，得到竹柏果仁油得率對提取溫度、回流時間、料液比的二次多項回歸模型方程：

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

(2)

不同因子交互作用的3D響應面圖見圖6～8，結合回歸模型X1X2、X1X3和X2X3的P值大小分析知，X1(提取溫度)和X3(料液比)對到竹柏果仁油提取率的交互作用相對明顯。

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Regression model analysis of variance

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

圖6 提取溫度與提取時間的交互作用Figure 6 Interactive effects extraction temperature and extraction time

圖7 提取溫度與料液比的交互作用Figure 7 Interactive effects extraction temperature and solid-liquid ratio

2.3 驗證性實驗

采用Design-expert 8.0.6軟件對響應面模型進行擬合，得最適提取條件為料液比1∶42.89 (g/mL)、提取溫度73.16 ℃、提取時間166.15 min，預測竹柏果仁油提取率31.22%。結合單因素優化結果并考慮到實際試驗操作條件，提取工藝修正為：料液比1∶40 (g/mL)、提取溫度75 ℃、提取時間150 min。此條件下進行實驗驗證，設置4次平行實驗。得到竹柏果油的平均提取率為29.32%，由于竹柏果實存在著不同的成熟度，會導致提取竹柏果油時有一定的誤差。與模型預測值誤差為8.99%，與預期相近。

圖8 提取時間與料液比的交互作用Figure 8 Interactive effects extraction time and solid-liquid ratio

2.4 理化指標分析

由表4可知，經檢測，竹柏果仁油所測的各項理化指標符合GB 2716—2005《食用植物油衛生標準》，可應用于食品、醫藥保健品。按照QB/T 4079—2010《按摩基礎油、按摩油》的要求，過氧化氫值≤10 mmol/kg，竹柏果仁油的過氧化氫值為27.76 mmol/kg，通過后期提取工藝的進一步改進與油脂精煉可用于化妝品行業。

表4 竹柏果仁油的理化性質?Table 4 The physicochemical properties of Podocarpus nagi nut oil

? *表示重復3次，**表示重復2次。

2.5 GC-MS分析

采用選擇性離子檢測的GC-MS方法對9種脂肪酸甲酯的總離子流圖進行掃描，得到竹柏果仁油樣品的總離子流圖見圖9，9種脂肪酸甲酯的含量見表5。

1. 十六碳酸 2. 十八碳酸 3. 十八碳一烯酸 4. 十八碳二烯酸 5. 十八碳三烯酸 6. 二十碳酸 7. 二十碳一烯酸 8. 二十碳二烯酸 9. 二十碳三烯酸

圖9 竹柏果油GC-MS總離子流Figure 9 Total ion flow of GC-MS in Podocarpus nagi nut oil表5 竹柏果仁油GC-MS成分分析結果Table 5 Analysis results of GC-MS composition of oil in Podocarpus nagi nut oil

由表5可知，竹柏果仁油主要化學成分為脂肪酸類，鑒別出9種脂肪酸，以亞油酸、二十碳三烯酸、十八碳一烯酸為主，不飽和脂肪酸含量達到95.81%，其中C20以上的長鏈不飽和脂肪酸占脂肪酸組成的33.76%。不飽和脂肪酸對人類健康大有裨益，可軟化血管、降低低密度脂蛋白和膽固醇、增強視力等作用[18]，其中亞油酸具有降低血中膽固醇、調節脂肪代謝、抑制或清除動脈血栓等作用。竹柏果仁油富含長鏈不飽和脂肪酸，在保健品領域有極大的開發前景。

3 結論

本試驗以成熟的竹柏果為原料，優化了超聲波輔助索氏抽提法提取竹柏果仁油的工藝條件，并研究了該油脂的基本理化性質及脂肪酸組成。研究發現，竹柏果仁油中不飽和脂肪酸含量達95.81%，且多不飽和脂肪酸總量為76.27%，顯著高于單不飽和脂肪酸。竹柏果仁油亞油酸含量相比同類陸生食用油脂優勢明顯，C20以上的長鏈不飽和脂肪酸占脂肪酸組成的33.76%。本試驗尚未對竹柏果仁油中不飽和脂肪酸的應用進行開發，有待進一步研究。