固相萃取—超高效液相色譜法測定水產品中6種氟喹諾酮類藥物殘留

賀 江 李曉月 仇玉潔 李博恩 楊品紅

(1. 湖南文理學院生命與環境科學學院，湖南 常德 415000；2. 環洞庭湖水產健康養殖與加工湖南省重點實驗室,湖南 常德 415000；3. 湖南省水產高效健康生產協同創新中心，湖南 常德 415000)

中國作為世界上著名的水產品養殖、生產和出口大國，水產品養殖產量約占世界2/3，而漁藥殘留問題一直都是各方關注的焦點。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolone，FQs)是一類十分重要的人工合成抗菌藥物，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、組織穿透力強、價格低廉、與其它抗菌藥物無交叉耐藥性等特點[1]，曾被廣泛應用于水產養殖業中。但不合理的用藥可導致氟喹諾酮類藥物及其代謝產物在水產品中的殘留，進而引起食用者腸道菌群失衡或產生遠期毒性作用及潛在“三致”(致癌、致畸、致突變)作用[2-3]。近年來，隨著社會對食品安全問題關注度逐漸增大，氟喹諾酮類藥物在水產養殖等領域的應用開始受到限制，或制定了相應的最大殘留限量(MRL)。歐盟和北美等國家早已在水產養殖業中禁用環丙沙星，中國也在NY 5070—2002《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》和NY 5071—2002《無公害食品漁用藥物使用準則》中將其列為禁用藥物。中國農業部于2015年又發布了第2292號公告，禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種氟喹諾酮類藥物在食用動物中的使用。歐盟及中國規定水產品中恩諾沙星及其代謝產物環丙沙星的最高殘留總限量為100 μg/kg。

建立方便有效的殘留檢測方法，是加強水產品中氟喹諾酮類藥物殘留監控的前提與基礎。目前，文獻報道中已有一系列的關于喹諾酮類藥物的檢測方法，如免疫分析法[4-5]、毛細管電泳法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、液相色譜-質譜聯用法[9-10]等。其中HPLC方法相對來說最普遍，但其在靈敏度和檢測效率上仍存在不足。超高效液相色譜技術(UPLC)是一種較傳統HPLC方法更加靈敏和快速的分析方法，隨著該技術的發展和普及，極有望替代HPLC成為新一代食品安全檢測技術標準。此外，在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中，樣品前處理的傳統方法多為液液萃取法，不僅復雜耗時而且精確度不高；而固相萃取(SPE)技術已在食品安全檢測中廣泛應用。本研究旨在基于固相萃取(SPE)和超高效液相色譜(UPLC)技術，建立可同時測定水產品中諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星6種氟喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法，為水產品的安全提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚、鳊魚、鯽魚、黃骨魚：市售；

氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、洛美沙星標準溶液：美國A ChemTek公司；

Cleanert PEP-2固相萃取柱：填料量200 mg，體積6 mL，博納艾杰爾公司；

乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；

磷酸二氫鉀、檸檬酸、乙酸銨、磷酸等：均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀(配有FLR熒光檢測器): Acquity H-Class型，美國Waters公司；

液相色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(1.76 μm，2.1 mm×50.0 mm)，美國Water公司；

高速冷凍離心機: Multifuge X1R型，賽默飛世爾科技中國有限公司；

固相萃取裝置: DG-24型， 美國Supelco公司；

電子分析天平: TX223L型, 日本島津公司；

氮吹儀: HAD-24B型，北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.3 方法與步驟

1.3.1 6種氟喹諾酮類藥物UPLC分析條件的優化及標準曲線的建立

(1) UPLC分析條件的優化：配置濃度均為500 ng/mL的6種氟喹諾酮藥物的混合標準溶液，設定進樣體積為0.2 μL，柱溫為50 ℃，檢測波長為λex=278 nm，λem=465 nm。參考有關文獻資料[11-14]，重點對流動相的類型和流速進行優化，以獲取最佳檢測效果。

(2) 標準曲線的建立：按照表1用乙腈分別配制氟喹諾酮系列混合標準溶液，采用已確定的UPLC分析檢測條件進行檢測，并進一步建立標準曲線。

表1 6種氟喹諾酮類藥物混合標準溶液的配制Table 1 Preparation of mixed standard solution of six fluoroquinolones

1.3.2 水產品中6種氟喹諾酮藥物檢測前處理方案的建立

(1) 固相萃取小柱的效果驗證：將2 mL濃度為500 ng/mL的混合標準溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL作為模擬提取液過SPE小柱(用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化)，再用3 mL 5%甲醇水淋洗，最后用6 mL甲醇洗脫。分別收集上樣過柱液、淋洗液、洗脫液，各取1 mL過0.22 μm濾膜上機檢測其中各種氟喹諾酮類藥物的含量，以驗證所用固相萃取柱的效果。

(2) 提取方案的選擇：準確稱取5 g經攪碎的魚肉樣品(并做加標處理)，分別加入10 mL酸化乙腈(2%甲酸)、鹽酸(1 mol/L)、四丁基溴化銨(3 mol/L)和磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.5)4種不同溶劑，渦旋混勻1 min后超聲波(40 kHz, 50 W)提取10 min，再于10 000 r/min離心10 min 取上清液，重復提取3次。合并提取液，按上述SPE操作進行凈化，洗脫液經氮吹濃縮至干后，殘渣用0.2%的甲酸水溶液溶解后過0.22 μm濾膜供UPLC分析。

1.3.3 方法評價

(1) 添加回收試驗和重復性試驗：按照表2所示A、B、C 3組不同的添加水平，在空白基質魚肉中添加標準溶液，每個添加水平重復3次，同時做空白試驗。按照所優化的方案進行前處理，再用所建立的UPLC方法檢測氟喹諾酮藥物的含量。用添加回收率評價方法的準確度，用多次檢測的添加回收率相對標準偏差(RSD)評價方法的精密度。

(2) 最低檢出限和最低定量限試驗：參照美國EPA標準中規定的單濃度重復試驗方法進行最低檢出限和最低定量限的測定[15]。

1.3.4 市售水產樣品中6種氟喹諾酮藥物的檢測 按照1.3.1 和1.3.2所優化的色譜方法和前處理方法，分別對某超市采購的草魚、鳊魚、鯽魚、黃骨魚進行氟喹諾酮類藥物檢測。

2 結果與分析

2.1 6種氟喹諾酮類藥物UPLC分析條件的優化及標準曲線建立

氟喹諾酮類藥物結構上有羧基和哌嗪基，具有酸堿兩性，又由于分子結構相似，給液相色譜分離帶來一定的難度。根據國內外相關文獻[11-14]報道，為防止色譜峰拖尾，通常選用酸性溶液如檸檬酸、乙酸銨、乙腈、甲醇、三乙胺等多種配比作為流動相。在本試驗條件下，嘗試采用多種流動相配比和流速。最終結果表明：以體積比為93∶7的0.05 mol/L 檸檬酸+0.1 mol/L 乙酸銨緩沖液-乙腈為流動相，流速為0.42 mL/min 時，在Waters Acquity UPLC?BEH C18柱(1.7 μm, 2.1 mm×50.0 mm)上10 min內將6種氟喹諾酮類藥物有效分開(圖1)，與傳統的HPLC方法相比，檢測效率明顯提高。以此色譜條件，分析1.3.1中氟喹諾酮系列濃度的混合標準溶液，得到6種氟喹諾酮藥物的標準曲線方程、決定系數R2和線性范圍見表3。

2.2 水產品中6種氟喹諾酮藥物檢測前處理方案的建立

2.2.1 固相萃取小柱的效果驗證 固相萃取柱應用效果的影響因素除填料類型外，也包括填料的粒徑以及填料裝填的緊密程度等，因此不同品牌的同一類型固相萃取柱也可能會產生不同的效果。本研究用標準溶液作為模擬樣品，對所選用的Cleanert PEP-2固相萃取小柱進行了有效性驗證。結果表明，上樣過柱液、淋洗液中均未檢出6種氟喹諾酮，而洗脫液中6種氟喹諾酮類藥物的含量與預期基本相符，回收率為95.9%～100.7%(表4)，說明選用的固相萃取柱有效。

表2 添加回收試驗中6種氟奎諾酮類藥物的 添加水平設置Table 2 Spiking levels of six fluoroquinolones in recovery test μg/kg

諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、洛美沙星濃度為160 ng/mL；培氟沙星濃度為40 ng/mL；恩諾沙星濃度為80 ng/mL

圖1 6種氟喹諾酮類藥物標準品的液相色譜圖Figure 1 UPLC chromatogram of six kinds of fluoroquinolones standard表3 6種氟喹諾酮類藥物的標準曲線方程和線性范圍Table 3 Standard curve equation and linear range of six kinds of fluoroquinolones

表4固相萃取過程中各部分收集液中6種氟喹諾酮類藥物的含量及回收率?

Table 4 Concentration and recovery of six kinds of fluoroquinolones in different part of solution during SPE process (n=3)

藥物名稱含量/(ng·mL-1)上樣過柱液a淋洗液洗脫液b回收率/%諾氟沙星未檢出未檢出166.77100.1氧氟沙星未檢出未檢出159.9095.9環丙沙星未檢出未檢出164.5698.7培氟沙星未檢出未檢出162.2297.3洛美沙星未檢出未檢出167.88100.7恩諾沙星未檢出未檢出161.1496.7

? a. 將2 mL濃度均為500 ng/mL的混合標準溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 mL作為模擬樣品進行上樣； b. 洗脫液體積為6 mL。

2.2.2 提取方案的選擇 樣品前處理過程中不同的提取劑的提取能力有很大差異，目前常用的提取劑主要有酸性乙腈[16]、磷酸鹽緩沖液[17]、鹽酸[18]、二氯甲烷[19]等水溶液或有機溶劑。為了最大效率提取樣品中6種氟喹諾酮類藥物，本研究比較了酸化乙腈(2%甲酸)、鹽酸(1 mol/L)、四丁基溴化銨(3 mol/L)和磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=4.5) 4種提取溶劑的提取效果，結果見表5。使用酸化乙腈提取時，樣品蛋白質極易快速沉淀，造成待測物包裹損失，提取效果不佳；使用1 mol/L的鹽酸溶液提取時，提取液中脂肪和蛋白質等雜質含量較高，后續凈化過程中易堵塞固相萃取柱；而四丁基溴化銨和磷酸鹽緩沖液提取時效果較好。綜合考慮，選用磷酸鹽緩沖溶液(pH 4.5)作為最終的提取溶劑。

2.3 方法評價

在確定UPLC分析條件和水產品中6種氟喹諾酮藥物提取、凈化等前處理方案的基礎上，本研究進一步對整套檢測方法的準確度、精密度和靈敏度進行了評價，結果見表6。由表6可知，6種氟喹諾酮藥物的添加回收率為63.69%～90.83%，最低檢出限為0.5～1.8 μg/kg，相對標準偏差均低于10%，表明方法的準確度、精密度和靈敏度均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量管理規范食品理化檢測》的相關要求。

2.4 市售魚樣品中6種氟喹諾酮藥物的檢測

按照1.3.1和1.3.2所優化的色譜方法和前處理方法，對常德市區某超市出售的草魚、鳊魚、鯽魚、黃古魚4種水產品進行了6種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測，相關色譜圖見圖2。結果表明：諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、洛美沙星5種禁用藥物在4種水產品中均未檢出；恩諾沙星在草魚、鳊魚、鯽魚中有檢出，黃古魚中未檢出，其中草魚中的殘留量低于檢測方法的最低定量限，鳊魚和鯽魚的殘留量分別為5.158，7.083 μg/kg，也均低于恩諾沙星在水產品肌肉中的最大殘留限量(100 μg/kg)。

表5 不同提取劑提取效果的比較Table 5 Comparison of extraction effects of different extractants

表6 水產品6種氟喹諾酮類藥物檢測分析方法準確度、精密度和靈敏度評價結果Table 6 The accuracy, precision, and sensitivity of the analysis methods for 6 kind of fluoroquinolones in aquatic products (n=3)

圖2 4種魚中氟喹諾酮類藥物殘留檢測色譜圖Figure 2 UPLC chromatogram of fluoroquinolones determination in grass carpa

3 結論

本研究基于固相萃取(SPE)和超高效液相色譜(UPLC)建立了水產品中的6種氟喹諾酮藥物殘留的檢測方法，并利用該方法對4種常見的市售水產品進行了分析。結果表明，該方法的前處理過程簡單有效，上機分析過程較傳統的HPLC分析耗時明顯縮短(10 min即可完成分析)；靈敏度明顯提高(最低檢出限為0.5～1.8 μg/kg)；準確度和穩定性符合檢測要求，添加回收率為63.69%～90.83%，相對標準偏差均低于10%。綜合說明，該方法有望為氟喹諾酮類藥物標準分析方法的建立提供借鑒和參考。