菝葜皂苷對胃癌BGC-823細胞Bcl-2、Bax凋亡蛋白表達影響的實驗研究

廖子君* 鄭 琪 趙 征 孫海鳳 龍 婧 陳 勇

（西安交通大學醫學院附屬陜西省腫瘤醫院，陜西 西安 710061）

菝葜為百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根莖，其主要成分是皂苷，且是以薯蕷皂苷元（菝葜皂苷元，sarsasapogenin，SAR））為主要苷元所衍生的皂苷。近年來，有學者對菝葜皂苷元誘導肝癌細胞HepG2凋亡進行了研究，獲得了陽性結果[1-2]。為了明確菝葜皂苷元對胃癌細胞是否具有誘導凋亡作用，我們進行了SAR對胃癌BGC-823細胞株Bcl-2、Bax凋亡蛋白表達水平影響的實驗研究，旨在尋找胃癌非細胞毒治療新藥。

1 材料與方法

1.1 細胞株：胃癌BGC-823細胞株（美國ATCC公司），在含10%的胎牛血清的RPMI1640培養液中培養，其內加入青霉素（100 μmol/L）、鏈霉素（100 μmol/L），置于5%CO2飽和濕度的培養箱內培養，0.25%胰酶消化傳代。

1.2 藥物與試劑：SAR購于中國藥品生物制品鑒定所（批號：110744-200509），用二甲基亞砜（DMSO）溶解，然后根據實驗需要用RPMI-1640培養液稀釋成實驗所需的不同濃度，其中DMSO含量均為1%，-20 ℃保存；RPMI-1640培養液；Bcl-2、Bax單克隆抗體，SP免疫組化試劑盒。

1.3 實驗方法：采用免疫細胞化學法檢測不同濃度12.5、25、50 μg/mL SAR對BGC-823細胞株Bax、Bcl-2蛋白表達的影響。按4×104/mL的密度將BGC-823細胞接種到放有蓋玻片的24孔板內，1 mL/孔；加入不同濃度SAR的RPMI1640培養液，對照組加入不含SAR的RPMI 1640培養液。一抗4 ℃過夜，次日復溫、洗滌后滴加二抗。用PBS代替一抗設置對照。在辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，DAB染色，蘇木素復染細胞核。

結果判定標準：Bax、Bcl-2均在細胞胞質表達，呈棕黃色，空白對照呈陰性。10×20倍鏡下隨機取5個視野，計算每個視野陽性細胞數，平均陽性細胞數占總計數細胞的10%以上者為陽性，平均陽性細胞數＜10%者為陰性（包括沒有或僅有弱的染色），陽性反應者用德國LeicaQ550cw圖像分析系統在統一光強，統一放大倍數（10×20）下測量表達情況，以染色最淡的視野為起點，隨機選取視野測定其灰度值（灰度值與實際表達強度呈反比，即灰度值越低，陽性表達越強；灰度值越高，陽性表達越弱）。作為Bax、Bcl-2陽性表達的量化指標，并進行統計學分析。

2 結 果

不同濃度12.5、25、50 μg/mL的SAR處理BGC-823細胞48 h后，經灰度分析可知，不同濃度SAR與對照組比較，均有統計學意義（P＜0.05），且Bax與SAR濃度呈正相關，Bcl-2與SAR濃度呈負相關，即隨著SAR濃度的增加，bax表達增加而bcl-2表達減少（見圖1和圖2、表1）。

3 討 論

圖1 各組BGC-823細胞bcl-2表達（IHC×200）

表1 SAR對BGC-823胃癌細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響（±s）

表1 SAR對BGC-823胃癌細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響（±s）

注：SAR不同濃度組與對照組比較，以及不同濃度組之間比較均是P＜0.05

groups Concentration of drug(μg/mL) Bcl-2 Bax Comparison group — 195.35±8.46 140.31±7.23 Experiment groups 12.5 181.44±9.14 153.16±8.37 25 172.43±8.26 168.97±7.56 50 150.79±9.57 185.76±7.48

2005年《Cancer J Clin》報道，2002年全球胃癌發病率位居第4位，病死率第2位；美國1930年～2004年胃癌總體發病率與病死率呈顯著下降趨勢，而中國每年胃癌新發病例占全部惡性腫瘤發病的17%以上，其病死率一直居高不下，僅次于肺癌[3]；2010年，中國腫瘤登記年報資料顯示，覆蓋2007年人口約5981萬，17個城市地區，21個農村地區，發病率前5位腫瘤為肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌。2017年1月25日，國家癌癥中心、全國腫瘤防治研究辦公室、全國腫瘤登記中心發表了《2012年中國惡性腫瘤發病和死亡分析》，報告稱2012年我國胃癌新發病例男性為29.8萬，位居第二；女性12.6萬，位居第四。因此，胃癌迄今仍是全球人口主要癌癥死亡原因[4]。有40%～50%胃癌患者明確診斷時已是局部晚期，無法行根治性切除，甚或遠處轉移，即使行根治性切除，遠期亦有40%以上的患者復發，復發的患者中約超過80%的患者有遠處轉移[5]。

近年來，為了延長中、晚期胃癌患者生存期、提高其生活質量，人們進行了大量探索，但均未有重大突破。筆者試圖從來自于天然植物的抗腫瘤活性成分中尋找對胃癌有治療作用的藥物，尤其對晚期胃癌合并惡液質的患者有一定緩解作用。

SAR是一種低毒的抗腫瘤活性成分，非細胞毒藥物。國內有學者研究證實[2-3]，SAR能誘導肝癌HepG2細胞發生凋亡，是一種由ROS作為早期信號所觸發的，并通過線粒體介導的過程。此外，SAR可在體外較顯著地降低酪氨酸激酶的活性。因此，推測SAR可能通過抑制細胞的信號轉導通路來誘導細胞凋亡。凌博凡等[6]的研究發現，菝葜皂苷元作用于人結腸癌LoVo細胞48 h后可誘導該細胞凋亡，阻滯細胞于G2/M期；其誘導細胞凋亡時伴隨著線粒體膜電位的降低，認為誘導凋亡的途徑可能與線粒體通路有關。

細胞凋亡受細胞內一系列基因的網絡式精細調控，在細胞凋亡的調控因素中，Bcl-2家族基因倍受矚目，其中Bcl-2基因是原癌基因，其突出作用是抑制細胞凋亡，Bcl-2蛋白廣泛存在于細胞的線粒體膜、細胞膜內表面、內質網、核膜等處[7]。Bax一方面能和Bcl-2形成異源二聚體抑制凋亡，另一方面其自身還能形成同源二聚體誘導凋亡。

圖2 各組BGC-823細胞bax表達（IHC，×200）

前期研究表明[8]，SAR對胃癌BGC-823細胞株有抑制生長作用，在MTT實驗中觀察到，隨著作用濃度的增加與時間的延長，這種增殖抑制作用愈明顯，與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；應用AnnexinV-PI雙標法檢測到SAR可以明顯誘導BGC-823細胞發生凋亡，BGC-823胃癌細胞在SAR濃度為50 μg/mL、作用時間為72 h時的凋亡率達到39.43%，與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

本研究是在該課題前期研究的基礎上，采用流式細胞儀檢測、觀察不同濃度SAR對BGC-823細胞株凋亡的影響，以及進一步應用免疫細胞化學法聯合灰度分析對Bax、Bcl-2陽性表達進行量化分析。研究結果發現，不同濃度12.5、25、50 μg/mL的SAR處理BGC-823細胞48 h后，經灰度分析，不同濃度SAR與對照組比較，均有統計學意義（P＜0.05），且Bax與SAR濃度呈正相關，Bcl-2與SAR濃度呈負相關，即隨著濃度的增加，bax表達增加而bcl-2表達減少。該研究提示，SAR具有誘導胃癌BGC-823細胞凋亡的作用。本研究為菝葜皂甙的進一步開發奠定了理論基礎。