多糖類凝膠滅菌方式的研究

趙 晶 蔣麗霞 董冰冰

（上海其勝生物制劑有限公司，上海 201106）

近年來，多糖類凝膠的研究熱點集中在透明質酸鈉、幾丁糖等，二者臨床應用廣泛。目前市場上多糖類凝膠多采用預灌封注射器（玻璃注射器+橡膠錐頭帽、膠塞）或西林瓶聯合丁基橡膠灌裝，必須達到無菌要求。法規對三類醫療器械的要求逐漸提高，2015年《中國藥典》滅菌法規定只要物品允許，應盡可能選用最終滅菌法滅菌，所以未來無菌產品的滅菌趨勢仍是終端滅菌。醫療器械常用的終端滅菌方法主要有干熱、濕熱、環氧乙烷（EO）、電離γ或β輻射[1]。這些方法通過物理或化學方式對細菌起到殺滅的效果，但在滅菌的同時可能導致這些生物高分子結構的不可逆變化，并最終影響產品的功能。

現今對于多糖類凝膠滅菌方式的研究報道較少。其中San Juan研究了幾丁糖凝膠的γ輻射滅菌，研究結果表明劑量為15 kGy時可使幾丁糖凝膠分子量降低80%[2]，而透明質酸鈉凝膠終端滅菌多集中在濕熱滅菌法。由此可見目前還沒有關于多糖類凝膠滅菌方式的系統研究，為此采用三種常規滅菌方式考察其對多糖類凝膠產品性能的影響，為該類產品的終端滅菌方式探索提供一定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料：幾丁糖凝膠（上海其勝生物制劑有限公司）、透明質酸鈉凝膠（上海其勝生物制劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 濕熱滅菌：取上述幾丁糖凝膠、透明質酸鈉凝膠樣品適量，取10支2.0×106孢子數/單位蒸汽滅菌生物指示劑（ATCC 7953；ACE test）裝在空注射器內，分別按照121 ℃、F0=8.0和F0=9.0參數進行濕熱滅菌。滅菌后，培養生物指示劑，觀察指示劑顏色變化。將試驗組和對照組分別檢測重均分子量。

1.2.2 環氧乙烷（EO）滅菌：本滅菌法主要考察滅菌的有效性和環氧乙烷的殘留量。

取上述幾丁糖凝膠、透明質酸鈉凝膠樣品適量，環氧乙烷滅菌參數分別選擇48 ℃滅菌18 h、54 ℃滅菌18 h；同時將10支EO滅菌生物指示劑置于空注射器內，另將10支1.5×106孢子數/單位EO滅菌生物指示劑（ATCC9372；ACE test）置于注射器外泡罩內，作為滅菌效果對照。滅菌后，培養生物指示劑，觀察指示劑顏色變化，檢測滅菌后重均分子量，檢測滅菌后初始、解析14 d、解析44 d環氧乙烷殘留量。

1.2.360Co-γ射線輻射滅菌：本滅菌法主要考察滅菌的有效性和樣品的外觀變化。根據ISO11137.2-2013 Sterilization of health care products-Radiation-Part 2:Establishing the sterilization dose選擇60Co-γ輻射滅菌最低劑量3 kGy（平均生物負載=1.0時達到SAL=10-2所需的輻照劑量）和常用的輻射滅菌吸收劑量25 kGy。生物指示菌分別采用102孢子數/單位和106孢子數/單位的金黃色葡萄球菌放置在空注射器內。

取上述幾丁糖凝膠、透明質酸鈉凝膠樣品適量，按照產品包裝方式包裝分別進行既定參數輻射滅菌。滅菌結束后，檢查樣品外觀，檢測重均分子量和生物指示菌的情況。

1.3 測定方法

1.3.1 重均分子量：將色譜柱通過激光散射儀與示差檢測器雙機連接，用0.1 mol/L的硝酸鈉-0.2‰疊氮化鈉溶液流動相清洗后的進樣器抽取用流動相稀釋的樣品，通過進樣環進樣，在規定的流速下檢測樣品的分子量。

1.3.2 環氧乙烷殘留量[3]

1.3.2.1 色譜條件：采用GC7890A氣相色譜儀Agilent J&W DB-624柱，柱溫：50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至120 ℃，后運行160 ℃。進樣口溫度：250 ℃，檢測器溫度：250 ℃。G1888 A頂空進樣器，進樣器爐溫60 ℃；定量環溫度70 ℃；傳輸線溫度80 ℃。樣品平衡時間：40 min。

1.3.2.2 樣品處理。錐頭帽：對解析完成后的樣品進行取樣，將樣品剪為5 mm長左右的碎塊（或10 mm2片狀物），稱取1.0 g放入20 mL頂空瓶中，精密加入10 mL水，密封萃取。

環氧乙烷殘留量：將1支幾丁糖凝膠樣品完全擠出至20 mL頂空瓶中，精密加入10 mL水，密封萃取。

1.3.2.3 檢測：采用外標定量法檢測，頂空進樣，待環氧乙烷色譜峰流出后，記錄環氧乙烷峰的面積值，得出標準曲線和供試液相應的濃度。

2 結果與分析

2.1 濕熱滅菌：兩種濕熱滅菌條件下，生物指示劑經培養后呈陰性，陽性對照生物指示劑正常生長，滅菌效果有效；幾丁糖凝膠重均分子量下降幅度較大，跌幅均在20%以上；透明質酸鈉凝膠重均分子量相對較小，在15%～20%（表1）。可見，濕熱滅菌對多糖類凝膠的重均分子量影響不同。

表1 三種終端滅菌方式對多糖類凝膠重均分子量的影響

2.2 環氧乙烷滅菌：兩種環氧乙烷滅菌參數下，泡罩內的生物指示劑經培養后均呈陰性，注射器內的生物指示劑經培養后均呈陽性，陽性對照指示菌正常生長，說明環氧乙烷氣體未能全部進入注射器內，不能有效地達到終端滅菌的效果。滅菌后凝膠含有大量的EO殘留，經過44 d解析后，48 ℃18 h滅菌樣品EO殘留在12 μg/支左右，54 ℃ 18 h滅菌樣品EO殘留則在22 μg/支左右（圖1）。

2.360Co-γ射線輻射滅菌：生物指示菌完全殺滅，滅菌有效；3 kGy輻射后的注射器呈淺棕色，25 kGy輻射后的注射器呈深棕色，可見60Co-γ射線輻射嚴重影響注射器的顏色。滅菌前后凝膠的外觀變化顯著，幾丁糖凝膠由液體凝膠狀變成半固體凝膠，透明質酸鈉凝膠由液體凝膠變成稀溶液，同時，二者重均分子量均出現顯著降低，幾丁糖降低50%以上，透明質酸鈉降低99%以上（表1）。顯然這種滅菌方式也不適合注射器類多糖凝膠的終端滅菌。

圖1 EO滅菌樣品環氧乙烷殘留量檢測結果（μg/支）

3 討 論

濕熱滅菌的參數選擇主要依據物品本身的熱穩定性和初始污染菌數量，由于多糖類凝膠的生產環境均是過程無菌，初始污染菌不得檢出，濕熱滅菌提高無菌保證水平達到10-6。因此對于多糖類凝膠濕熱滅菌的選擇主要取決于該物品的熱穩定性。幾丁糖凝膠屬于天然可降解的多糖產品，其穩定性比較差，采用濕熱滅菌作為最終滅菌方式時，高溫加熱可使幾丁糖降解[4]，重均分子量驟降。2015年版中國藥典滅菌法規定對于熱不穩定性物品的F0值一般不低于8 min。本研究即使采用最低滅菌時間121 ℃ F0=8.0，幾丁糖滅菌后的重均分子量降低20%以上，且動力黏度與重均分子量存在一定的正相關性，重均分子量的降低，勢必影響凝膠重要的性能動力黏度的降低。而透明質酸鈉凝膠經濕熱滅菌，重均分子量的降低較小，可保證產品沒有發生較大的熱降解，能達到臨床應用的要求。說明濕熱滅菌的選擇依賴于產品本身的熱穩定性，以及臨床需求。因此，多糖類凝膠可以根據產品本身的性質以及臨床需要選擇濕熱滅菌方式進行終端滅菌。

采用EO滅菌，預灌封注射器的玻璃材質EO無法穿透，EO只能通過橡膠材質的錐頭帽和膠塞進入制品，穿透性差，注射器內產品殺滅值達不到SAL≤10-6，滅菌效果不理想；而且橡膠制品材質易吸附EO氣體，滅菌后凝膠內存在大量的EO殘留，按照貯存要求在2～8 ℃條件下存放44 d后，凝膠仍有較多殘留，解析緩慢，超過GBT 16886.7-2001醫療器械生物學評價第7部分：環氧乙烷滅菌殘留量要求的安全標準（1.25 μg/支）。另外，多糖類凝膠主要成分為有效成分和生理緩沖液，含水和氯離子，殘留EO易與水反應生成次乙二醇（EG），與氯反應生成2-氯乙醇（ECH），其中ECH屬中等毒性物質，不易降解，具有致突變性，容易會造成急性中毒事故，特別是造成嚴重中樞神經損傷和腦水腫[5]。據此分析，在產品貯存條件下，環氧乙烷的殘留量的下降并非是環氧乙烷真正從產品中解析出去，而是與產品中的氯離子和水發生化學反應所致。總體來說，環氧乙烷滅菌對于預灌封注射器產品的滅菌既存在不易穿透進去達不到預期的滅菌效果，又存在進入到注射器內不易解析出來而產生臨床使用安全性的問題。因此，考慮到滅菌的有效性和臨床使用的安全性，EO滅菌不適用于多糖類凝膠的最終滅菌。

采用60Co-γ射線輻射滅菌，即使采用最低劑量3 kGy，依然導致注射器顏色發生顯著變化，凝膠的重均分子量下降50%以上。幾丁糖分子本身擁有大量的羥基，60Co-γ的穿透性很強，在高劑量的γ輻射條件下，很容易介導幾丁糖中的氨基、羧基基團間的交聯反應，且這種交聯反應大多發生在分子間，交聯后的幾丁糖凝膠空間網絡極為致密，致使產品由液體凝膠轉變為半固體凝膠，彈性提高，而黏性急劇下降，這也就改變了幾丁糖原來的分子結構，失去了與預期用途相關的基本性質。而透明質酸鈉凝膠經60Co-γ輻射滅菌變成液體，學術上尚未有相關報道，可能因為高劑量的γ輻射導致主鏈斷裂，失去原有的凝膠性質。顯然這種滅菌方式也不適合多糖凝膠的終端滅菌。

通過以上對產品理化性質和滅菌方法的研究分析，環氧乙烷滅菌和輻照滅菌終端滅菌方式均不適用于多糖類凝膠的終端滅菌，而濕熱滅菌的選擇則取決于多糖類凝膠本身的性質和臨床用途。