ACM復合rBMSC修復兔股骨內髁關節軟骨缺損的價值

劉 拴 張明勇 胡 冰

(武漢科技大學附屬天佑醫院骨科，湖北 武漢 430064)

1 材料與方法

1.1實驗動物 48只3月齡健康新西蘭白兔，雌雄各半，購自南京模式動物研究所。

1.2試劑與材料 注射用鹽酸氯胺酮(北京雙鶴藥業股份有限公司)；鹽酸異丙嗪注射液(成都倍特藥業有限公司)；鹽酸利多卡因注射液(山西晉新雙鶴藥業有限責任公司)；免疫組化SP試劑盒(中國醫學科學院生物工程研究所)；Ⅱ型膠原一抗(上海美迪西生物醫藥有限公司)；胎牛血清(北京生物制品研究所)；注射用青霉素鈉(桂林南藥股份有限公司)；乙二胺四乙酸、多聚甲醛、DMEM以及胰蛋白酶均購自美國Sigma公司。脫細胞軟骨支架材料為本實驗室自行制成，經常規消毒等處理后保存于干燥環境中。

1.3儀器設備 手術各操作器械、實驗臺等由本實驗室提供；二氧化碳培養箱(Hcracus公司)；相差倒置顯微鏡(德國AFM公司)；組織包埋機及切片機(泰維科技有限公司)；顯微攝影成像系統(徠卡公司)；數碼相機(德國萊次公司)。

1.4實驗方法

1.4.1組織工程軟骨的制作 采用密度梯度離心和差速貼壁法獲得原代兔BMSC，在培養期間，進行光鏡觀察2次。當細胞間隙變大，出現漩渦狀孔隙時添加等體積FBS將胰酶中和，吸出細胞液后將瓶壁上細胞層反復沖洗，制成單細胞懸液。吸取懸液15 ml，離心3 min，棄上清，加入DMEM液重懸單細胞懸液，經細胞計數板計數。取豬膝關節軟骨，經清洗、冷凍和干燥處理后分為骨粉末，使用胰酶消化和清洗，消毒后待用。取無菌ACM手工切成4 mm×4 mm×3 mm體積大顆粒，分別放入6孔板中，將稀釋至1×106個/ml的BMSC單細胞懸液，滴加至6孔板中，37℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下孵育2 h。

1.4.2膝關節軟骨缺損動物模型的制作和修復 48只新西蘭白兔，隨機分為3組，ACM-BMSC組，ACM組，空白對照組。各個組再分為6 w和12 w時間點。將新西蘭白兔稱重后，記錄重量，根據重量，注射鹽酸氯胺酮2 ml/kg，每只新西蘭白兔注射一支鹽酸異丙嗪，注射方式為臂肌注射；對于膝關節區目標手術部位先脫毛后再牢固固定，常規消毒之后給予1%利多卡因麻。于兔膝關節前內側入路，暴露膝關節，屈曲膝關節，充分暴露股骨內側踝。制造軟骨缺損3 mm深，達軟骨下骨且能夠感覺到有突破感、孔內滲血。將組織工程化骨植入缺損部位并壓滿。伸直術側膝關節后復位髕骨，縫合切口。術后追加使用抗生素，青霉素80萬U/d。新西蘭白兔分開飼養，自由活動。

1.5主要觀察指標 6 w、12 w時分別處死8只新西蘭白兔，取出膝關節標本仔細觀察。將動物標本常規使用4%多聚甲醛固定后使用EDTA脫鈣3個月，常規制備石蠟切片，經HE染色和免疫組化染色后在光鏡下觀察。同時進行Wakitani組織學評分。Wakitani組織學評分：分為細胞形態、基質染色、表面平整、軟骨厚度、接合、總分。細胞形態，全部為透明軟骨為0分，大多數為透明軟骨為1分，主要是纖維軟骨為2分，大多數不是透明軟骨為3分，無透明軟骨為4分。基質染色，正常為0分，略有減少為1分，顯著減少為2分，其他為3分。表面平整，平整超過3/4為0分，居中(1/2～3/4)為1分，不規則為2分，非常不規則為3分。軟骨厚度大于2/3為0分，1/3～2/3為1分，不足1/3為2分。接合，接合較好為0分，只有1邊接合為1分，均不接合為2分。總分：滿分14分，分值越低，軟骨缺損修復越好。

其中：被解釋變量Lapro為勞動生產率。解釋變量Time為時間虛擬變量，表示最低工資標準實施前后，實施前為0，實施后為1。解釋變量Treat表示是否落實最低工資標準的虛擬變量，落實為1，未落實為0。Time×Treat表示解釋變量Time和Treat的乘積，系數β3表示最低工資標準對于企業勞動生產率的影響。控制變量X表示影響企業勞動生產率的其他因素，包括企業特征和所在地區經濟發展水平。

1.6統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行秩和檢驗。

2 結 果

2.1實驗動物大致觀察分析 三組實驗動物關節腔沒有看到感染積液，沒有發生關節腔粘連情況。術后6 w：ACM-BMSC組，與附近正常組織新生軟骨完全填充，表面基本接合，表面光滑、乳白色；ACM組新生軟骨不完全填充，與附近正常組織有所接合，表面不光滑、偏白色；空白對照組新生軟骨填充很少，與附近正常組織不接合，表面裂隙較多、偏白色；術后12 w：ACM-BMSC組完全修復，與附近正常組織完全接合，表面光滑、乳白色；ACM組不完全修復，與附近正常組織接合處仍有裂隙，表面不光滑、偏白色；空白對照組修復較少，與附近正常組織不接合，表面裂隙較多、偏白色。術后6 w和12 w關節缺損部位直接觀察結果見圖1。

圖1 關節缺損部位觀察

2.2術后關節組織學觀察 術后6 w ACM-BMSC組修復組織與周圍組織接合良好，表層可見梭形成纖維細胞，縱軸與表面平行，修復細胞呈圓形透明軟骨樣細胞，基質染色與周圍正常軟骨基質比較有所下降，潮線清晰。ACM組修復組織與周圍組織有所接合，表層細胞層次排列紊亂，深層可見成纖維樣細胞修復，細胞深層可見透明軟骨樣細胞，基質染色與周圍正常軟骨基質比較明顯下降，潮線無。空白對照組無明顯類軟骨組織修復，僅有少量類肉芽組織。術后12 w ACM-BMSC組修復組織與周圍組織接合良好，表層可見梭形成纖維細胞，縱軸與表面平行，修復細胞呈圓形透明軟骨樣細胞，基質染色與天然軟骨組織接近，潮線清晰。ACM組修復組織與周圍組織有所接合，表層細胞層次排列紊亂，深層可見成纖維樣細胞，修復細胞深層可見透明軟骨樣細胞，基質染色與周圍正常軟骨基質比較明顯下降，潮線無。空白對照組無明顯類軟骨組織修復，僅有少量類肉芽組織。見圖2。

2.3Wakitani組織學評分比較 在同一時間段內，不同組間細胞形態、基質染色、表面平整、軟骨厚度、接合、總分比較，ACM-BMSC組和空白對照組、ACM組和空白對照組比較，差異顯著(P<0.05)；ACM-BMSC組和ACM組比較無差異顯著(P>0.05)。見表1。

圖2 術后關節組織學觀察(HE，×100)

時間組別細胞形態基質染色表面平整軟骨厚度接合總分6 wACM-BMSC組1.49±0.441)1.39±0.461)0.79±0.661)0.59±0.611)0.79±0.641)4.99±1.221)ACM組1.79±0.471)1.59±0.481)0.89±0.571)0.59±0.481)0.88±0.541)5.79±0.881)空白對照組2.49±0.331.58±0.471.88±0.540.88±0.571.79±0.468.59±1.2212 wACM-BMSC組1.29±0.481)0.99±0.411)0.88±0.471)0.49±0.491)0.77±0.411)4.43±1.441)ACM組1.49±0.471)1.38±0.441)0.79±0.411)0.59±0.481)0.88±0.541)5.09±1.551)空白對照組2.29±0.441.49±0.371.99±0.751.09±0.331.49±0.378.39±1.11

與空白對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

組織工程學作為一門以細胞生物學與材料學核心內容的新興學科，其主要通過重新構建組織器官修復和改善疾病，主要分為種子細胞、生物材料和體內微環境等內容〔4～7〕。目前，軟骨細胞、充質干細胞是臨床上主要使用的細胞類型。在大量人體和動物試驗中均有實踐證明，國內的多項研究也證實自體軟骨細胞在其中有更好的軟骨成骨效果〔8～10〕。而異體軟骨細胞雖然能夠通過包裹基質被植入，但卻容易遭到自然殺傷細胞的攻擊。有研究指出，若采用同種異體軟骨細胞復合的支架材料進行關節軟骨修復，有確切效果，在一定程度上豐富了種子細胞的來源〔11，12〕。間充質干細胞具備多種分化的潛能，且若應用BMSC不僅取材來源與操作方便，對供體也不會產生明顯影響，分離培養十分方便，體外增殖能力也十分理想，來源也不受限制〔13〕。

目前，組織工程中支架材料主要包括兩種，一種是天然生物可降解材料，另一種是人工合成生物可降解材料〔14,15〕。組織工程支架材料需要有良好的生物相容性和降解性，具備三維多孔立體結構，要有一定的機械強度。在軟骨組織工程中，支架材料則應該有足夠的孔隙結構，促進細胞黏附和增殖，可以通過表面修飾等，對細胞的黏附和生長進行調控〔16〕。還需要具備一定的彈性，支架還需要能夠和周圍的組織融為一體，不容易缺損和脫落。當然，這些都是理想狀態的要求，至今尚未發現存在。

本文所獲得的BMSC作為種子細胞，生長良好，純度較高。生物材料方面，細胞外基質(ECM)作為軟骨支架材料中的重要部分，具備連接、支持等作用。通過處理后，ACM最大程度保留了細胞賴以生存的細胞外基質，與生物天然軟骨基質成分十分接近，適合細胞生存。近幾年，細胞和支架的接種技術的不斷發展，臨床上已經出現了沉淀法、浸漬法、吸附法等多種技術。本文結果顯示脫細胞軟骨支架材料在解剖和組織結構上均基本達到了本研究預期的修復目標，但其修復細胞的排列方式和正常軟骨細胞依然存在一定的區別。研究更為完美的修復方法有著更為重要的實踐價值。

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