通絡玉液湯對2型糖尿病心肌病大鼠心功能及心肌纖維化的影響

李淑貞 楊艷梅 楊曉暉 崔茂香

(滄州醫學高等專科學校,河北 滄州 061001)

最新數據〔1〕顯示，中國成年人糖尿病患病率高達11.6%，由此推測目前中國有1.139億糖尿病患者，其中2型糖尿病(T2DM)患者占糖尿病總數的90%～95%。糖尿病心肌病(DC)是糖尿病所致心血管系統損害的重要并發癥之一，可引起糖尿病患者心功能下降，最終導致充血性心力衰竭、心源性休克及猝死，與糖尿病患者心血管事件的高發生率和高死亡率密切相關〔2〕。研究證實轉化生長因子(TGF)-β1是一種多功能生長因子，在DC發病中具有重要作用。通絡玉液湯是在玉液湯、生脈散原方基礎上加減化裁而成，具有益氣養陰、活血通絡之效。本實驗通過心功能和TGF-β1等指標的觀察，探討通絡玉液湯對DC大鼠的治療作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 通絡玉液湯(生曬參、生黃芪、生山藥、麥冬、知母、花粉、葛根、五味子、雞內金等)中藥飲片均購自滄州同仁堂藥店。浸泡、煎煮、濃縮成2.5 g生藥/ml的液體；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國 Sigma 公司。TRIZON 購自新西蘭Invitrogen公司，RNA逆轉錄試劑盒購自 TIANGEN生化科技(北京)有限公司，SYBR Green 實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司。

1.2模型建立與藥物干預 SPF級48只健康雄性SD大鼠 〔中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心提供，合格證號：SCXK-(軍)2009-003〕，體重 150～180 g。適應性喂養1 w后，參考董世芬等〔3〕方法，并根據預實驗結果，分為正常對照組(NC組) 和模型組。模型組先用高脂高糖飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇和67.5%基礎飼料)喂養4 w，然后一次性腹腔注射1% STZ 30 mg/kg，72 h后測大鼠空腹血糖(FBG)，>11.1 mmol/L認為是T2DM大鼠模型成功，持續高脂高糖飼料喂養6 w，即成DC模型。NC組一直采用基礎飼料喂養，等量枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)代替STZ腹腔注射，不采血。選擇成模大鼠36只隨機分為3組：DC組，苯那普利陽性藥物對照組(BP組)，通絡玉液湯組(TYD組)。TYD組灌服通絡玉液湯煎劑25 g·kg-1·d-1；BP組灌服苯那普利 1 mg·kg-1·d-1；NC組和DC組每日灌服相應劑量的生理鹽水，連續8 w。

1.3左心室功能檢測 實驗結束各組10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，備皮仰臥位固定，進行彩色多普勒超聲心動圖檢查。二維超聲測量：左心室收縮末期內徑(LVISD)、左心室舒張末期內徑(LVIDD)及射血分數(EF)，短軸縮短率(FS)。

1.4血糖及水平的測定 各組禁食不禁水12 h，由頸總動脈取血檢測FBG。

1.5膠原容積分數的測定 大鼠處死后取一部分左心室心肌組織以4%多聚甲醛固定，石蠟切片，常規Masson染色，光鏡下觀察心肌細胞呈紅色或黃色，膠原纖維呈藍綠色，拍片，掃描，采用圖像分析儀測量膠原容積分數(CVF，CVF=同一圖像中膠原面積/所測視野面積)。每個切片選取5個視野取其平均數。

1.6免疫組化測定心肌組織中TGF-β1蛋白表達 石蠟切片，常規脫蠟至水，抗原修復，血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。陽性判定標準：以細胞質被染成棕褐色為陽性結果。每組標本切片隨機選取10個高倍視野，借助于HPIAS2000多媒體彩色病理圖像分析系統測定各組切片陽性顆粒的平均灰度值反映TGF-β1的表達水平。

1.7實時定量RT-PCR測定心肌組織中TGF-β1 mRNA的表達 ①RNA提取與cDNA的合成：取100 mg心肌組織，加入Trizol 1 ml，冰浴勻漿，提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度與濃度，電泳法檢測其完整性；取0.5 μg總RNA反轉錄cDNA。②實時熒光定量PCR：按照 RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR 檢測。以β-actin為內參，引物設計TGF-β1：正義5′-GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA-3′，反義5′-GGAAGGGTC-GGTTCATGTCAT-3′，擴增片段長度為330 bp；β-actin的引物：正義5′-ATATCgCTgCgCTCgTCgT-3′，反義5′-TCTCTTGCTCTGGGCCTCGT-3′。PCR的反應條件：預變性95℃ 60 s；變性95℃ 10 s；58℃退火20 s；72℃延伸20 s，40個循環。引物均由上海賽百盛基因技術有限公司合成。以β-actin為內參，采用ΔCt(ΔCt目的-ΔCt內參)法進行相對定量分析，以2-ΔCt作為目的 RNA 的相對表達量。

1.8統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1TYD對DC大鼠血糖的影響 與NC組〔(5.82±1.12)mmol/L〕比較，DC組FBG〔(24.33±3.74)mmol/L〕明顯升高(P<0.01)；經用藥干預后，各治療組FBG明顯降低，與DC組比較，TYD組〔(10.42±2.52)mmol/L〕差異有統計學意義(P<0.01)，BP組〔(23.98 ±4.09)mmol/L〕差異無統計學意義；與BP組比較，TYD組FBG明顯降低(P<0.01)。

2.2TYD對DC大鼠左心室功能的影響 與NC組比較，DC組LVISD及 LVIDD明顯增大(P<0.01)，EF和FS明顯下降(P<0.05)；經用藥干預后，各治療組LVISD及 LVIDD顯著降低，EF和FS顯著升高，與DC組比較LVISD、EF和FS差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，但BP組和TYD組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 各組心功能的比較

與NC組相比：1)P<0.01，2)P<0.05；與DC相比：3)P<0.01，4)P<0.05

圖1 各組心功能超聲心動圖結果

2.3Masson染色觀察各組膠原表達情況 光鏡下：NC組心肌纖維完整，細胞形態規則，膠原纖維主要分布在血管周圍，心肌細胞間有少量的膠原纖維，著色淡；DC組心肌纖維排列紊亂，心肌間隙增寬，有大量縱橫交錯的膠原纖維，排列紊亂，分布不勻；BP組和TYD組心肌肌纖維排列基本規則，膠原纖維量要明顯少于DC組，尤以TYD組顯著。見圖2。與NC組(7.38±1.81)%比較，DC組CVF值(28.95±7.35)% 顯著升高(P<0.01)；經用藥干預后，各治療組CVF值降低，與DC組差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；TYD組CVF值(18.73±5.10)% 小于BP組(23.07±6.33)%，但兩者差異無統計學意義。

2.4大鼠心肌組織TGF-β1基因、蛋白的表達 免疫組化結果：NC組心肌細胞胞質內可見少許黃色染色顆粒，TGF-β1無或微量表達；DC組TGF-β1大量表達，部分心肌細胞內呈彌漫性強染色；BP組和TYD組心肌細胞內免疫復合物染色范圍及強度均較輕，TGF-β1少量表達，以TYD組最為明顯。定量分析：與NC組比較，DC組TGF-β1平均灰度值顯著降低(即TGF-β1蛋白表達顯著增強，P<0.01)；經用藥干預后，治療組TGF-β1平均灰度值明顯升高(即TGF-β1蛋白表達減弱)，與DC組相比差異有統計學意義(P<0.05)；與BP組比較，TYD組TGF-β1平均灰度值升高，但二者差異無統計學意義。見圖3。實時熒光定量RT-PCR檢測結果：與NC組比較，DC組TGF-β1的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；經用藥干預后，各治療組TGF-β1的mRNA表達水平較DC組顯著下降(P<0.01)。與BP組比較，TYD組TGF-β1的mRNA表達水平明顯下降(P<0.05)。見表2。

圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)

圖3 各組心肌組織TGF-β1免疫組化(×400)

組別TGF-β1蛋白TGF-β1 mRNANC120.59±10.020.016 89±0.004 0DC96.44±10.061) 0.165 31±0.057 51)BP105.66±6.783)0.106 00±0.026 72)TYD107.38±7.653) 0.062 67±0.021 72)4)

與NC組相比：1)P<0.01；與DC組相比：2)P<0.01，3)P<0.05；與BP組相比：4)P<0.05

3 討 論

DC作為一種特異的糖尿病心血管并發癥，是一種獨立于冠心病、高血壓、先心病和其他種類的心臟病之外的特異心臟病變，與糖尿病患者心力衰竭的高發生率和高死亡率密切相關〔4〕。DC的主要病理變化是心肌間質纖維化，從而增加室壁的僵硬度，降低心室順應性，導致心臟舒張與收縮功能障礙，最終引發心力衰竭。研究發現〔5～7〕，TGF-β1是一種多功能細胞因子，在調節細胞外基質的形成中起重要作用，是體內重要的促纖維化細胞因子，與糖尿病患者的心肌纖維化密切相關：①持續高血糖可直接刺激TGF-β1表達，引起心肌成纖維細胞分泌膠原，加速心肌纖維化；②高血糖引發的氧化應激可通過增加核因子(NF)-κB進入細胞核使得TGF-β1轉錄增多，從而刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成，引起心肌纖維化；③高糖狀態下，心肌經過磷脂肌醇信號PKc途徑使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)被激活，血管緊張素(Ang)Ⅱ表達增多，刺激心肌成纖維細胞中的TGF-β1分泌增多，促進Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成增加、分解減少，最終造成心肌肥厚及心肌纖維化。因此，抑制心肌組織中TGF-β1的高表達成為DC治療的靶標。

本實驗表明心臟收縮舒張及射血功能明顯降低；DC與高血糖狀態下的TGF-β1高表達有關，與文獻報道相符〔8〕。本實驗說明通絡玉液湯可有效降低血糖，并通過降低TGF-β1的表達來減輕DC心肌損傷，改善心功能，對DC大鼠心臟起明顯的保護作用。

4 參考文獻

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