宮頸癌患者癌組織中內(nèi)皮特異性分子-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白的表達(dá)及意義

宋曉環(huán)

(長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理教研室，吉林 長春 131300)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，與高危型人乳頭狀病毒(HPV)感染密切相關(guān)，發(fā)病率僅次于乳腺癌〔1,2〕。近年相關(guān)文獻〔3～6〕報道內(nèi)皮特異性分子(ESM)-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)都與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究探索ESM-1和VEGF是否參與宮頸癌的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1對象與分組 選取2016～2018年經(jīng)吉林省人民醫(yī)院病理科確診的宮頸癌組織150例和癌旁宮頸組織30例作為研究對象，平均年齡分別為(52.6±1.4)歲和(53.3±1.9)歲。宮頸癌組織根據(jù)臨床分期：Ⅰ期51例、Ⅱ期59例、Ⅲ期40例，根據(jù)病理類型：高分化62例、中分化45例、低分化43例，根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移63例、無轉(zhuǎn)移87例。全部病例在術(shù)前均未接受任何放、化療，不合并其他臟器官疾病，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。

1.2主要試劑和儀器 兔抗人ESM-1、VEGF抗體、SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購于福州邁新生物有限公司。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒購于塔克拉公司。Leica切片機(德國Leica公司)；OLYMPUS BX51光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；7300型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3ESM-1和VEGF mRNA水平檢測 首先設(shè)計、合成引物，由上海生物工程有限公司合成，序列為GADPH引物(371 bp)：上游5′-GATTGTTGCCATC-AACGACC-3′,下游5′-GTGCAGGATGCATTGCTGAC-3′；ESM-1引物(523 bp)：上游5′-AACTATGCTGAAGTCTTAGGA-3′,下游5′-TCAGAACTGAGTAAGGCCTG-3′；VEGF引物(287 bp)：上游5′-TGGGCCAGCAATTGTTCACA-3′,下游5′-ATTGTCTTGCCATCATGCTAG-3′。Trizol提取總RNA然后反轉(zhuǎn)錄，通過預(yù)變性、變性、退火、延伸及40個循環(huán)進行實時熒光定量PCR檢測，檢測得Ct值，每個樣本基因擴增3次，取平均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)水平，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.4樣本中ESM-1、VEGF蛋白陽性表達(dá)強度的檢測 組織石蠟切片3 μm，每個樣本2張，65℃烤箱烘片2 h，然后常規(guī)脫蠟至水洗，采用檸檬酸抗原修復(fù)液煮沸10 min進行抗原修復(fù)，分別滴加ESM-1、VEGF抗體，抗體為即用型，其余步驟嚴(yán)格按照SP9710試劑盒說明書進行，DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，封片。OLYMPUS顯微鏡觀察，200倍鏡下拍攝圖片連續(xù)5個視野，采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件，檢測光密度值(OD值)，OD值越大陽性表達(dá)越強。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗、χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組ESM-1和VEGF mRNA水平比較 與癌旁宮頸組織比較，ESM-1和VEGF mRNA水平隨宮頸癌分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期表達(dá)明顯增強，隨宮頸癌病理類型高、中、低分化表達(dá)明顯增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組ESM-1和VEGF蛋白陽性表達(dá)強度比較 與癌旁宮頸組織比較，ESM-1和VEGF的蛋白陽性表達(dá)強度隨宮頸癌分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期表達(dá)明顯增強，隨宮頸癌病理類型高、中、低分化表達(dá)明顯增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.3ESM-1和VEGF陽性表達(dá)率和臨床病理特征的關(guān)系 ESM-1和VEGF的陽性表達(dá)率在不同臨床分期、病理類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 三組ESM-1、VEGF mRNA及蛋白水平的比較

與癌旁宮頸組織比較：1)P<0.05；與Ⅰ期比較：2)P<0.05；與Ⅱ期比較；3)P<0.05，與高分化比較:4)P<0.05；與中分化比較:5)P<0.05

圖1 各組ESM-1蛋白陽性表達(dá)強度(×200，免疫組化SP法染色)

圖2 各組VEGF蛋白的陽性表達(dá)強度(×200，免疫組化SP法染色)

臨床病理特征nESM-1+-陽性率(%)VEGF+-陽性率(%)臨床分期Ⅰ期512526 49.0224 2747.06Ⅱ期593920 66.101) 362361.021)Ⅲ期4037392.501)2)35587.501)2)病理類型高分化6227 3543.5525 3740.32中分化4534 1175.563)321371.113)低分化4340 393.023)4)38588.373)4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有63 59493.6556788.89 無87 424548.285) 394844.835)

與Ⅰ期比較:1)P<0.05；與Ⅱ期比較:2)P<0.05；與高分化比較:3)P<0.05；與中分化比較:4)P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較:5)P<0.05

2.4ESM-1和VEGF mRNA水平及蛋白陽性表達(dá)強度的相關(guān)性分析 ESM-1和VEGF mRNA水平及蛋白陽性表達(dá)強度均呈正相關(guān)(r1=0.529，P1=0.026；r2=0.601，P2=0.035)。

3 討 論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌，其發(fā)病率逐年年輕化且發(fā)病率、死亡率高，嚴(yán)重威脅女性患者的生命健康和生活質(zhì)量〔1,2〕。近年來手術(shù)治療雖然有一定的效果，但中、晚期患者術(shù)后仍易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，因此尋找新的治療手段是腫瘤專家的熱衷研究課題。ESM-1是1996年從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中克隆出的一種新型內(nèi)皮細(xì)胞，是一種可溶性蛋白多糖，具有調(diào)節(jié)VEGF的功能〔2～4,7〕。眾多研究〔8,9〕證實在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中轉(zhuǎn)移、浸潤與腫瘤新生血管密切相關(guān)。ESM-1既能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生長又能改善腫瘤細(xì)胞微環(huán)境〔7,10〕；VEGF是促血管生成因子，具有多功能性，能直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進血管生成，還能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)血管生成〔11～13〕。因此，ESM-1、VEGF與腫瘤發(fā)病機制的研究成為熱點，探索ESM-1、VEGF能否成為腫瘤靶向治療的靶點備受關(guān)注。本實驗結(jié)果顯示，ESM-1和VEGF參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤，阻斷二者的表達(dá)可能為宮頸癌靶向治療提供新的指導(dǎo)與靶點。

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