四川曬醋醋醅中一株產纖維素酶的芽孢桿菌分離篩選

劉軍，江若宇，王麒麟，帖余，王鑫，李麗

(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢,643000)

四川曬醋是屬于我國“四大名醋”[1]之一的四川麩醋，它以麩皮、大米為主要原料，沿用歷史傳統秘方的釀制技藝，經蒸煮、發酵、日曬(其醋坯和成品醋均經日光暴曬)、陳釀四大工藝流程，20多道工序制成，故簡稱“曬醋”，其產品色澤黑褐、無沉淀、香氣芬芳，具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長、久存不腐的特點[2]。四川曬醋以麩皮為主要釀制原料，固態開放式多菌種混合接種，輔以獨特的藥曲配方，采用糖化、酒化、醋化同池進行發酵，形成獨特微生物群落結構和風味物質。

王祝健[3]等發現，在陜西醋醅中存在著大量的芽孢桿菌，分離出的大部分芽孢桿菌都具有產酸的能力，且對成品醋的口感及香氣有重要的影響。許偉[4]等從鎮江香醋醋醅分離得到4株芽孢桿菌發現，都具有產有機酸和產吡嗪類物質的能力。因此，發酵過程中對芽孢桿菌的控制程度會影響食醋品質。

由于釀造原料中含有大量的纖維素，而纖維素是一種由葡萄糖組成的很難降解的多糖，它的存在會導致原料利用率低下，因此，本試驗的目的是找到1株能降解纖維素的微生物，從而提高原料利用率。

本文從曬醋醋醅中分離得到多株芽孢桿菌，以產纖維素酶為主要指標，以產蛋白酶、淀粉酶為輔助指標進行比對，得到幾株產酶能力較強的芽孢桿菌，并對其進行分類學鑒定，為四川曬醋的醋酸發酵優化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

試驗菌種：從四川某曬醋廠醋醅中分離得到。

試劑：蛋白胨、可溶性淀粉、酵母膏、牛肉膏、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、NaCl、干酪素、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、(NH4)2SO4、瓊脂、胰蛋白胨、溴甲酚紫、3,5-二硝基水楊酸等，均為分析純，購于成都科龍化工試劑公司。

1.1.2 培養基

富集培養基(質量分數)：蛋白胨1%，可溶性淀粉0.3%，酵母膏0.3%，KH2PO40.15%，K2HPO40.2%，MgSO40.1%，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

完全培養基(質量分數)：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂15%～20%，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

選擇培養基(質量分數)：羧甲基纖維素鈉1%，NaCl 0.125%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.4%，MgSO40.05%，瓊脂20%，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(質量分數)：羧甲基纖維素鈉1%，NaCl 0.125%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.4%，MgSO40.05%，121 ℃滅菌20 min。

酪蛋白培養基(質量分數)：干酪素0.5%，葡萄糖0.1%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，K2HPO40.05%，MgSO40.01%，瓊脂15%，pH值7.2，115 ℃滅菌30 min。

淀粉酶培養基(質量分數)：可溶性淀粉0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.5%，瓊脂15%，pH值7.2，115 ℃滅菌30 min。

LB培養基(質量分數)：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min，121 ℃滅菌20 min。

穿刺培養基(質量分數)：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.05%，NaCl 0.05%，瓊脂0.08%，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

產酸產氣發酵培養基質量分數：酵母膏0.1%，葡萄糖0.1%，溴甲酚紫0.4%，115 ℃滅菌30 min。

葡萄糖蛋白胨水培養基質量分數：K2HPO40.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.5%，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設備

DM500正置生物顯微鏡,德國萊卡；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺,蘇州凈化；G154DS立式自動壓力蒸汽滅菌器,致微儀器有限公司；SHP-350生化培養箱,北京中興偉業儀器有限公司；KD-LS空氣搖床,廣州番禺旭東阪田電子有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司；300V400MA75W 電泳儀,北京洪濤基業科技發展有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋,上海科恒實業發展有限公司；CP214電子天平,奧豪斯儀器有限公司；S1000 PCR儀,上海菲特科學器材有限公司；PiCo21 臺式高速離心機,北京線上生物科技有限公司；SC805凝膠成像系統,成都一科儀器設備有限公司；DHG-9070A立式鼓風干燥箱,上海捷呈實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

取四川省某曬醋廠醋醅發酵4、8、12、16、20 d的醋醅。

1.2.2 芽孢桿菌的分離純化和保存

取1 g醋醅于 100 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩后，取4 mL接種于100 mL的無菌富集培養基中，37 ℃，150 r/min下，培養48 h。將富集培養基在90 ℃水浴熱加熱10 min，得到芽孢的富集液。取1 mL芽孢富集液進行10倍濃度稀釋后，取適當質量濃度的菌懸液涂布到完全培養基上，37 ℃培養24～48 h，然后觀察并記錄各平板中菌落形態以及培養基上透明圈的大小等形態。

從不同平板上挑取長勢良好、透明圈較大的典型單菌落進一步純化，直到確認是形態一致的單菌落后，經革蘭氏染色鏡檢，觀察細胞形態，判斷是否進一步純化。之后將單菌落于斜面培養基37 ℃培養24 h后，保存于4 ℃冰箱待用。

1.2.3 產纖維素酶的芽孢桿菌的分離純化和保存

稱取10 g醋醅置于帶有玻璃珠的200 mL 無菌生理鹽水中，搖床振蕩30～60 min，取10 mL菌液加入100 mL 發酵培養基中進行富集培養，37 ℃、 150 r/min培養24 h，取富集培養液進行梯度稀釋、涂布于選擇培養基上，37 ℃培養 48 h，挑取單菌落點接選擇性培養基中，37 ℃恒溫培養48 h后，倒入1 mg/mL剛果紅溶液染色10 min，倒去剛果紅溶液，向平板加入1 mol/L 的NaCl 溶液浸泡15 min 脫色，觀察菌落周圍有無水解圈，并測量菌圈比，并且將產纖維素酶活力較強的菌株進行保藏[5-6]。

1.2.4 菌株的形態學和生理生化鑒定

將菌株進行平板劃線，在選擇培養基上37 ℃培養 48 h后，對菌株的單菌落進行觀察，并參照《伯杰氏細菌手冊》[7]相關內容進行檢測。

1.2.5 菌株16S rDNA的分子生物學鑒定

將培養12 h的菌液1.5 mL，12 000 r/min離心1 min得菌體，采用細菌DNA提取試劑盒法提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA。以菌株的基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。

PCR反應體系為50 μL：模板5.0 μL，正反向引物各0.5 μL，10×buffer 5.0 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。

PCR反應條件為：預變性： 94 ℃， 4 min；變性： 94 ℃， 1 min；退火： 55 ℃， 1 min；延伸： 72 ℃，1 min；循環數： 20；終延伸： 72 ℃， 10 min。

1.2.6 分離菌株系統發育樹的構建

將菌株序列再GenBank 數據庫終進行BLAST同源性對比分析，運用Mega 6.0軟件構建系統發育樹，根據菌株間的親緣關系確定所選菌株的種屬。

1.2.7 纖維素粗酶液的提取

按體積分數為3%的接種量接種于裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、 150 r/min 培養48 h，吸取菌液2 mL 于 EP 管中， 4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液即為纖維素酶粗酶液。

1.2.8 酶活的測定

通過DNS比色法測定還原糖的量來測定纖維素粗酶液的酶活[8],按公式(1)計算：

(1)

式中：M，吸光度在標準曲線上計算出的葡萄糖質量，mg;P，為反應體系體積，mL;N，稀釋倍數；T，反應時間，min；V，參加反應酶液體積，mL。

1.3 數據處理

采用Excel、Origin 8.5等軟件作圖，測定結果以平均值±標準差表示[9]；菌株系統發育樹采用Mega 6.0軟件進行建立。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的初篩

本研究從四川曬醋醋醅中篩選出了14株芽孢桿菌菌株，編號為YB1.1～YB9.1，YB1.2～YB9.2。

2.2 菌株形態學特性

從菌落形態觀察中可知，從四川曬醋醋醅中分離得到的芽孢桿菌菌落主要分為乳白和微黃色，圓形居多，表面濕潤，菌落較大，邊緣不整齊。革蘭氏染色為紫色，其細胞形態為鏈狀。如圖1所示。

圖1 芽孢桿菌形態特性Fig.1 Strains physiological form

2.3 菌株生理生化特征

將分離出的菌株在平板上進行劃線，37 ℃培養24 h后，參照《伯杰氏細菌手冊》對菌株進行了部分生理生化試驗，結果如表1所示：菌株甲基紅、V-P、產酸、穿刺、接觸酶試驗均為陽性，芽孢是否膨脹、產氣為陰性。

2.4 產酶試驗

通過產淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶試驗，比較菌株的產酶能力的大小，結果見表2所示。

由表2可看出，產3種酶能力較強的菌株有YB5.1、YB3.2、YB8.2、YB9.2。其中YB5.1產3種酶能力均強于其他菌株。

2.5 菌株的16S rDNA的分子鑒定

根據透明圈大小和產酶實驗結果，確定YB5.1為目的菌株，因而對YB5.1進行研究。以菌株YB5.1的基因組為模板，PCR擴增出16S rDNA 序列后送生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，大小約為1 600 bp，電泳檢測結果如圖 2、圖3所示。

表1 菌株部分生理生化特征Table 1 Partly biochemical and physiological characteristics of the strain YB5.1

注：+表示陽性，-表示陰性。

表2 產酶實驗Table 2 Enzyme production experiment

注： “+”是菌株產生的透明圈，透明圈越大，“+”越多。“-”代表沒有透明圈產生。

A、B-菌株YB5.1基因組提取產物；C-模板基因圖2 DNA電泳圖Fig.2 DNA electrophoresis

D、E-菌株YB5.1基因組PCR擴增產物；F-模板基因圖3 PCR擴增產物電泳圖Fig.3 The electrophoresis of PCR products

圖2表明基因組DNA提取成功。

由圖3可知，產物的bp數大概在1 600左右，表示16S rDNA擴增成功。

將測序所得到的序列利用 DNAMAN 6.0 完成拼接，利用 NCBI 數據庫進行BLAST比對，發現 YB5.1 16S rDNA與芽孢桿菌屬相似度最高。下載芽孢桿菌的典型菌種 16S rDNA序列，用Clustal進行比對，用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構建系統發育樹(圖4) ，獲得目的菌株的分類地位和它的系統發育地位，結果表明 YB5.1 16S rDNA 與Bacilluscereus(KC248212.1) 同源關系最近，其可信度達到了99。再結合其生理生化特征分析可知分離菌株YB5.1鑒定為蘇云金芽胞桿菌屬(Bacillusthuringiensis)。

圖4 菌株YB5.1的N-J系統發育樹Fig.4 N-J phylogenetic tree of strain YB5.1

2.6 菌株產纖維素酶活能力

根據測得的吸光度作圖，菌株產纖維素酶活能力見如圖5。經過37 ℃，48 h培養后，菌株YB3.1、YB3.2、YB8.2的產纖維素酶活較高，分別達到了94.56，101.41和96.15 u/g；而YB5.1的纖維素酶活最高，達到161.33 u/g。此次篩選出的產纖維素酶活較高的芽孢桿菌YB5.1可為川南曬醋的發酵優化提供基礎。

圖5 菌株產纖維素酶活能力Fig.5 Cellulase production capacity of strains

3 結論

本研究采用高溫處理，從四川曬醋醋醅中篩選出1株高產纖維素酶的芽孢桿菌，并對其產酶特性進行分析。通過平板劃線和平皿生化反應法對四川曬醋醋醅中的芽孢桿菌進行分離純化，篩選出1株產纖維素酶酶活較高的芽孢桿菌YB5.1，進而通過16S rDNA的同源序列分析對該菌株進行遺傳學鑒定，確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌屬(Bacillussugenbacillus)。該菌株在產纖維素酶，產蛋白酶及淀粉酶能力上均優于其他菌株，其產纖維素酶活達到了161.33 u/g。