自擬促神經再生因子復合劑對大鼠脊髓損傷后凋亡相關蛋白bcl-2，bax，Caspase-3表達的影響＊

祁　健，張俊江，趙廷寶

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）為脊柱骨折的最嚴重并發癥［1］，脊髓損傷后患者運動或感覺功能發生障礙給患者本人帶來了旁人難以理解的身心痛苦，給家庭及社會帶來巨大傷害及沉重負擔，嚴重影響了家庭穩定、社會和諧［2-5］。

脊髓損傷后的病理生理變化及損傷機制是一個復雜的級聯反應過程［6-8］，目前已經基本闡明的病理機制主要有兩種：包括機械性損傷導致的原發性損傷和血管、生化反應所致的繼發性損傷［9-11］。原發性損傷為高能量暴力作用于脊柱脊髓瞬間所造成的物理性損傷，多為不可逆性損傷，容易造成神經細胞的壞死，繼發性損傷是原發性損傷的延續和發展，是多種因素參與的瀑布式級聯放大反應。目前認為參與的機制有：血管機制、自由基學說、興奮性氨基酸學說、炎癥反應、電解質紊亂以及鈣離子超載等，一系列繼發性反應引起神經細胞的凋亡［12］。如果在臨床中任其發展，對脊髓組織產生的損害甚至超過原發性損傷。所以針對繼發性損傷的機制研究及如何阻斷繼發性損傷的病理變化，是脊髓損傷治療的熱點。

促神經再生注射劑（專利號：ZL201210115594.1，即N6復合制劑）是原濟南軍區總醫院脊髓修復科根據多年臨床經驗研制的一種專利復合制劑。前期的研究已經驗證了N6在大鼠脊髓損傷模型中能抑制凋亡蛋白［13］，保護受損神經細胞，體外細胞培養實驗同樣驗證了N6保護神經細胞，避免其凋亡。該課題在前述實驗基礎上，通過復制大鼠脊髓損傷模型，在損傷后不同時間點，經蛛網膜下腔注射N6，觀察N6不同時間點對于神經細胞保護作用的影響。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物采用雄性成年SD大鼠，250～300 g，SPF級，由原濟南軍區總醫院實驗動物中心提供，合格證編號20140006。實驗過程中每籠飼養不超過3只動物，保持室內恒溫（22～25℃）。為不干擾動物晝夜生物節律，動物室每日8：00～20：00開燈。實驗預先得到濟南軍區總醫院動物實驗委員會的認可。

脊髓撞擊器 （NYU/MASCIS Impactor modelⅡ）。 試劑：兔抗 bcl-2（1∶500，3498，cell Signal），兔抗 bax（1∶500，5032，Cell Signal），兔抗 Caspase-3（1∶500，9665，Cell Signal）及兔抗 actin（1∶500，BM0627，博士德），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG （1∶500，ZDR-5306，北京中杉）。 tunel試劑盒（全式金，FA201-01）。

1.2方法

1.2.1脊髓損傷大鼠模型的制備及評價統一采用由Allens創建的重物墜落法 （Weight dropping，WD 法）［10］經由 NYU（NYU/MASCIS Impactor modelⅡ）脊髓撞擊器建立大鼠急性脊髓損傷模型。術后用 BBB 評分（Basso，Beattie&Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）評估SCI后后肢運動功能，以及曠場實驗評估，將出現運動距離降低的視為造模成功。

1.2.2分組將SD大鼠隨機分為3組，即對照組：脊髓損傷后不同時間點（8 h，16 h）內注射生理鹽水，鞘內注射。甲強龍組：脊髓損傷后不同時間點（8 h，16 h）注射甲強龍（30 mg/kg），鞘內注射。N6 合劑組：脊髓損傷后不同時間點（8 h，16 h）注射 N6（25 μl），鞘內注射。

1.2.3HE染色戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，之后用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）200 ml經主動脈沖洗血液。將含有多聚甲醛（2%）以及飽和苦味酸（75%）的500 ml，0.1 mol/L磷酸緩沖液進行固定。取腦組織，之后放入固定液中后固定4 h，將腦組織放入含有蔗糖（30%）的0.1 mol/L的磷酸緩沖液中，放入冰箱（4℃），待其沉底。進行HE染色，具體步驟如下：（1）脫蠟至雙蒸水；（2）玻片放入蘇木素液 5 min，雙蒸水漂洗 1 min；（3）1%鹽酸乙醇溶液分化 20 s，雙蒸水漂洗 30 s；（4）0.6%氨水返藍 30 s， 水洗 30 s；（5）1%伊紅染色 3 min，水洗 30 s；（6）無水乙醇溶液脫水 3 次，5 min/次；（7）放入二甲苯透明 5 min；（8）用中性樹膠封片。光鏡下觀察脊髓切片的組織結構。

1.2.4TUNEL法計數脊髓凋亡細胞數灌注取材同上，具體步驟同下：（1）切片脫蠟至雙蒸水；（2）抗原修復：組織上滴加蛋白酶K工作液，放于濕盒內，室溫下孵育15 min。（3）破膜：組織上滴加0.3%Triton X-100，常溫下孵育10 min。PBS洗滌3次，每次5 min；（4）阻斷內源性過氧化物酶：將切片置于3%H2O2溶液中，常溫避光孵育 20 min；（5）取 Tunel試劑盒試劑 1 （TdT）和試劑 2（dUTP）按 1∶9 的比例混合均勻，滴加到切片上，放入濕盒中，37℃水浴鍋孵育 60 min；（6）滴加試劑 3 （coverter-POD）于組織上，放于濕盒內。放入37℃水浴鍋內孵育30 min；（7）DAB顯色：滴加DAB顯色液，鏡下觀察染色反應，當胞核呈現棕黃色時，停止反應，雙蒸水沖洗；（8）復染細胞核：蘇木素復染約3 min，1%鹽酸乙醇溶液進行分化，0.6%氨水返藍約3 min；（9）脫水封片：切片依次在70%、80%、90%、95%乙醇溶液、無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ脫水至透明，中性樹膠封片；（10）光學顯微鏡進行拍照，每個玻片組織隨機選取5個視野，計算均數，Image-Pro Plus6.0分析計數陽性細胞。

1.2.5DAB顯色灌注取材同上，具體步驟同下：（1）3%H2O2封閉 10 min，羊血清封閉 30 min；一抗室溫下孵育 6～8 h，然后放到 4 ℃冰箱 3 d；（2）生物素化（biotin）的驢抗兔抗體（1∶200，Vector），室溫下孵育 4 h；（3）在 A 液 B 液（1∶200，Chemicon）中室溫下孵育2 h；（4）DAB溶液呈色，含有 DAB 0.04 g、Tris-HCl 10 ml、過氧化氫20μl。在DAB中呈色30 min后，切片變為淺棕色。在顯微鏡下觀察，終止反應。裱片，脫水透明。抗體稀釋液為含5%山羊血清、0.3%Triton X-100、0.05% （w/v） 疊氮鈉的 PBS。觀察用數字照相機（VANOX；奧林巴斯，日本，東京）。

1.2.6Western Blot方法按照實驗分組，取手術后不同時間點的動物，將大鼠快速取腦，冰上分離內側前額葉皮質，加入含有苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的單去污裂解液，勻漿裂解30 min，將勻漿裂解液移入1.5 ml離心管，于1200 r/min，4℃離心5 min，留取上清液，分裝于0.5 ml離心管，BCA法進行蛋白濃度測定，確定蛋白的上樣體積。蛋白樣品采用8%的SDS-PAGE進行電泳分離，加入預染的Marker，根據預染Marker的位置確定所需蛋白bcl-2，bax，Caspase-3及actin的位置，將所需蛋白條帶剪下，然后將膠上蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上做免疫雜交反應。用含5%BSA封閉2 h后，然后加入兔抗 bcl-2（1∶500，cell Signal），兔抗bax（1∶500，Cell Signal），兔抗 Caspase-3（1∶500，Cell Signal）及兔抗 actin（1∶500，博士德），4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶500，北京中杉），37℃孵育1 h，ECL曝光。PVDF膜常溫曬干后進行條帶掃描并分析，對比灰度值，比較不同實驗組蛋白的表達變化。

1.3統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行分析，采用兩因素相應析因設計對應的方差分析進行統計，不同組之間對比采用LSD-t檢驗，取P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1HE染色觀察脊髓損傷后組織的變化情況HE染色可觀察到脊髓組織結構的完整性及炎癥細胞浸潤等情況。光鏡下可見脊髓損傷后8 h脊髓組織結構紊亂，炎性細胞浸潤明顯，部分視野空泡形成，無明顯神經元細胞；脊髓損傷后8 h應用N6合劑組脊髓組織結構紊亂減輕，同樣有炎性細胞浸潤，可見殘存神經元細胞（圖1），統計學結果顯示與脊髓損傷后8 h應用甲強龍組、脊髓損傷后16 h應用N6合劑組相比，差異具有統計學意義（圖2）。

圖 1　HE染色后不同組脊髓組織結構及殘存神經細胞

2.2TUNEL染色觀察脊髓損傷后給予不同藥物的細胞凋亡情況脊髓損傷后，給予不同藥物治療后，可見不同數量的胞核呈褐色的陽性凋亡細胞。脊髓損傷后8 h有大量胞核呈褐色的陽性細胞；脊髓損傷后8 h給予生理鹽水治療組，可見大量胞核呈褐色的陽性細胞；脊髓損傷后8 h給予N6治療組，可見數量不等的胞核呈褐色的陽性細胞（圖3）。經統計，與脊髓損傷后16 h給予N6治療組相比差異具有統計學意義（圖4）。

2.3DAB染色觀察脊髓損傷后給予不同藥物后caspase-3陽性細胞數量caspase-3陽性細胞為細胞質褐色或黃褐色，胞核為藍色的細胞。可見脊髓損傷后8 h有大量胞核呈褐色的陽性細胞；脊髓損傷后8 h給予生理鹽水治療組，可見大量胞核呈褐色的陽性細胞；脊髓損傷后8 h給予N6治療組，可見數量不等的胞核呈褐色的陽性細胞（圖5），與脊髓損傷后16 h給予N6治療組相比差異具有統計學意義（圖 6）。

2.4Western-blotting檢測caspase-3，bax及bcl-2蛋白表達水平Western-blotting實驗可以觀察到脊髓損傷后Caspase-3、bax蛋白表達增加，8 h給予N6后可以減少Caspase-3、bax蛋白的表達，與給予甲強龍組相比存在統計學意義，與16 h給予N6相比存在統計學意義 （圖7～10）。觀察到脊髓損傷后bcl-2蛋白表達減少，8 h給予N6后可以增加bcl-2蛋白的表達，與給予甲強龍組相比存在統計學意義，與16h給予N6相比存在統計學差異（圖11、12）。

圖 2　HE染色后不同組殘存神經細胞的比較

圖 3　Tunel染色后不同組脊髓組織結構中的凋亡細胞

圖 4　Tunel染色后不同組凋亡細胞數量的比較

圖 5　DAB染色后不同組脊髓組織結構中的caspase-3陽性細胞

圖 6　DAB染色后不同組caspase-3陽性細胞數量的比較

圖 7　分子生物學實驗檢測Caspase-3在各組大鼠的表達量

圖 8　Caspase-3在各組大鼠的表達量的比較

圖 9　分子生物學實驗檢測bax在各組大鼠的表達量

圖 10　bax在各組大鼠的表達量比較

圖 11　分子生物學實驗檢測Bcl-2在各組大鼠的表達量

圖 12　Bcl-2在各組大鼠的表達量比較

3　討論

該實驗通過建立大鼠急性脊髓損傷模型，檢測損傷后凋亡相關蛋白表達量的變化及計數神經細胞凋亡數，結果提示 N6復合劑在大鼠脊髓損傷后可以抑制神經細胞的凋亡，且N6復合劑的早期應用更有利于大鼠脊髓神經細胞的恢復。

研究表明脊髓損傷后細胞分為壞死和凋亡［14，15］。壞死發生在機械性損傷后，為不可逆性，細胞內蛋白水解酶水解周圍組織，引起細胞自溶，炎性細胞浸潤。凋亡為細胞程序性死亡，為機體受到內外環境的刺激后，清除自身損傷細胞的過程。脊髓損傷后神經元凋亡多發生在繼發損傷階段，在一定的外界因素干預下，可阻止凋亡的發生，從而保護受損傷的神經細胞，促進脊髓康復。由于凋亡是一個多種活性因子參與的信號轉導過程，研究并發現這些內在的信號轉導，是阻止細胞走向凋亡的基礎。

目前發現真核細胞凋亡傳導通路主要有4條途徑：（1）死亡因子及其受體介導的外部傳導途徑［16］；（2）線粒體凋亡途徑（內部信號傳導途徑）［17］；（3）內質網途徑；（4）B粒酶凋亡途徑。目前為止，細胞凋亡的確切分子機制還不清楚，但細胞凋亡涉及一系列胞質內凋亡蛋白的活化及底物的裂解，目前的研究熱點是Caspase蛋白家族及bcl-2蛋白家族。

Caspase蛋白家族現已有14個家族成員，激活的Caspase家族成員根據在凋亡過程中所發揮的作用分為不同種類：凋亡始動組，凋亡效應組，炎性反應組［18］。其中凋亡效應組的Caspase-3是凋亡過程中最為關鍵的酶，被稱為“死亡蛋白酶”，它的激活被看作是細胞進入了不可逆凋亡階段的重要標志。該實驗觀察到脊髓損傷后Caspase-3表達增高，給予N6后能抑制其增高，表明N6對脊髓損傷修復有作用。

Bcl-2/bax蛋白家族成員同樣在細胞凋亡進程中扮演著重要的角色，它既可以促進細胞的凋亡，又可以阻止細胞走向凋亡［19］。通過家族成員之間不同比例及構象的變化，發揮著對細胞凋亡調節的雙重作用。目前為止，bcl-2蛋白家族可分為兩類：（1）抗凋亡亞族，它包括 bcl-2、A1、bcl-w、bcl-xl等；（2）促凋亡亞族，一類含有BH1-3三個結構域的bax/bak/bok等，另一類含有BH3結構域的Bid/bad/bik等。在細胞正常狀態時，促凋亡蛋白多位于胞質內，并被抗凋亡蛋白所結合，處于無效狀態，在接收到胞內凋亡信號后，唯BH-3蛋白與抗凋亡蛋白結合，進而釋放促凋亡蛋白 BH1-3，如 bax、bak，這些被釋放并通過構象變化活化的促凋亡蛋白，會通過C端特殊的疏水性跨膜結構域插入到線粒體外膜上，促進細胞色素C釋放入胞質，進而引起細胞走向凋亡［20］。細胞凋亡途徑及信號轉導過程中關鍵的蛋白酶為Caspase-3及bcl-2/bax，代表了細胞凋亡的兩個經典途徑，該實驗應用分子生物學和形態學的方法，觀察了脊髓損傷后不同時間點給予N6對Caspase-3及bcl-2/bax蛋白酶表達變化的影響。結果提示早期應用N6可以減少Caspase-3及bax蛋白酶的表達，同時增加bcl-2的表達。該結果表明N6促進脊髓損傷的恢復，是阻止了細胞凋亡途徑及信號轉導過程，主要是減少了促凋亡蛋白酶Caspase-3及bax的表達，同時增加了抗凋亡蛋白酶bcl-2的表達。