乳腺癌侵襲轉移中Artemin作用的探討

張路漫 ，田 剛 ，魏殿軍

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市公安醫院檢驗科，天津300010；3.天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津300211；4.天津醫科大學醫學檢驗學院，天津300010）

近年來由于工作節奏的加快和生活環境的變遷，影響女性身心健康的惡性腫瘤發病呈上升趨勢，據不完全統計生殖系統惡性腫瘤占女性新發癌癥總數的將近一半。乳腺癌居女性各類惡性腫瘤死亡率之首，侵襲轉移是惡性腫瘤加重病情變化的主因，如何早期發現乳腺癌病灶，抑制瘤細胞血道淋巴道遠端轉移成為各研究機構的焦點問題。神經膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）家族配體中Artemin（ARTN）作用獨特，目前的研究表明，ARTN是一個癌基因，在不同的腫瘤組織中表達水平有所不同，該基因在腫瘤組織中的異常激活可能與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移相關[1]。ARTN在乳腺癌侵襲轉移中的作用，國內尚少見報道。本研究試圖從ARTN角度探索其與乳腺癌侵襲轉移的關系，為早期診斷乳腺癌遏制其發生提供一些有價值數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本和細胞系 乳腺癌組織標本來自天津市公安醫院2000年6月-2010年6月手術切除的39例乳腺癌患者。其對應的乳腺癌旁正常組織標本作為對照組。調閱住院乳腺癌患者病歷，結合隨訪資料完善基本資料分析。乳腺癌MDA-MB-231細胞株由天津醫科大學實驗中心惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 細胞培養基（Hyclone公司）；Artemin（abcam Biotechnology公司）；兔抗人β-actin多克隆抗體（Invitrogen公司）。超凈工作臺（細胞培養專用，中國Air Tech）；Olympus IX70倒置顯微鏡（日本 Olympus）；轉膜儀：(Bio-Rad)；凝膠成像系統 (Kodak 440CF)；ID KODAK凝膠成像系統（美國Kadak公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231用含 10%NBS、100 μg/mL 鏈霉素、100 U/mL 青霉素的RPMI-1640培養，在37℃、5%CO2細胞培養箱中每48 h更換培養液1次。細胞進入對數生長期后，胰酶消化成熟細胞后清洗死細胞，用1 mL完全培養基終止消化后吹打為單細胞懸液，接種到6孔板內繼續培養準備后序試驗。

1.2.2 siRNA質粒轉染 把對數生長期的適量細胞平鋪到培養皿中，溫箱培養24 h；用移液槍旋轉加入 1.6 μg 質粒和 4 μL Lipofectamin 2000，混勻后室溫放置20 min；細胞表面滴加質粒DNA-脂質體復合物，輕輕搖勻培養皿后放5%CO2孵化箱內培養，6 h后換成普通1640培養液；細胞轉染24 h后傳代；貼壁細胞加入HygromycinB，熒光篩選單克隆細胞[2]。

1.2.3 免疫組化檢測Artemin表達 應用免疫組化檢測臨床乳腺癌標本石蠟切片中Artemin蛋白表達情況。按照操作說明書進行，染色淺黃至棕黃色為陽性細胞。

1.2.4 劃痕實驗 細胞平鋪6孔培養板孵育過夜，待細胞對數生長期鋪滿培養皿后，沿比例尺用移液槍對培養基中貼壁細胞劃線。散落的破碎細胞用PBS沖洗，加入無血清培養基放培養箱中饑餓細胞。0 、6、9、12、24 h 測量劃痕處細胞愈合距離，不同的測定點取均值后繪制曲線。

1.2.5 趨化運動實驗 在趨化小室的下室加入用含0.5%精制胎牛血清的培養液配置不同濃度的EGF溶液，混勻的細胞懸液加入上室。37℃CO2培養箱孵育2 h后棄去未粘附細胞，固定染色后倒置顯微鏡下觀察穿膜細胞。

1.2.6 粘附實驗 細胞消化計數后離心，重懸于培養基配成密度為2.7×105個/mL細胞懸液。不同濃度EGF刺激后冰浴終止反應，固定染色后鏡下計數粘附細胞數。

1.2.7 細胞侵襲實驗 Transwell小室中加入已融化的Matrigel膠。將細胞重調濃度加入上室，下室加入含10%血清的培養基，37℃孵育48 h后，去除未穿膜的細胞，固定細胞后結晶紫染色，顯微鏡下觀察穿膜細胞數。

1.3 統計學分析 研究資料用SPSS 11.0軟件進行處理，組間比較采用方差分析或t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 免疫組化檢測Artemin在乳腺癌組織中表達 39例乳腺疾病患者其中淋巴結轉移的26例，淋巴結未轉移的13例。在26例淋巴結轉移病例中，有24例Artemin表達陽性（P=0.003）。然而，在無淋巴結轉移13例病例中，只有1例Artemin表達陽性（圖1）。提示Artemin的表達與乳腺癌轉移具有相關性。本研究未發現Artemin的表達與腫瘤大小有關。

2.2 siRNA技術分析MDA-MB-231細胞中Artemin表達情況

2.2.1 Artemin降表達的MDA-MB-231細胞蛋白表達水平 穩定轉染MDA231細胞而獲得siATRN-MDA231，同時用一段無關序列轉染MDA231細胞作為陰性對照（scr表示）。用Western blot檢測Artemin的表達情況。和scr/MDA231細胞比較，siATRN-MDA231細胞Artemin的蛋白表達水平明顯降低。

2.2.2 Artemin表達降低對MDA-MB-231細胞遷移和定向運動能力影響 siATRN-MDA231細胞遷移和定向運動能力明顯比對照組降低（圖2）。

2.2.3 Artemin降表達對細胞趨化運動影響 Artemin降表達的細胞趨化運動能力降低（圖3）。

2.2.4 Artemin降表達對MDA231細胞粘附能力影響 粘附于纖維粘連蛋白的scr/MDA231細胞數量在EGF刺激下經5和15 min的不同間隔明顯增加。siATRN-MDA231細胞經過相同的EGF刺激時間間隔有較少的數量增加（圖4）。

圖4 Artemin降表達對MDA231細胞粘附能力影響Fig 4 Effect of Artemin down-expressin on adhesion of MDA231

2.2.5 siATRN-MDA231細胞侵襲能力觀察 對照組和siATRN-MDA231細胞平均視野侵襲細胞數量之比為250.65/52.22個，siATRN-MDA231細胞穿透matrigel膠的能力明顯低于對照組，與對照組相比侵襲能力下降了 76.5%（P＜0.01）（圖5）。

圖5 siATRN-MDA231細胞侵襲能力變化Fig 5 Change in invasion of siATRN-MDA231 cells

3 討論

在西方乳腺癌是最普通的惡性腫瘤之一，在患有惡性腫瘤的婦女死亡病例中位于第二位。近年來我國乳腺癌的發病率有上升的趨勢。如何預防乳腺癌發病，特別能盡早有效抑制癌細胞轉移，是治療乳腺癌的關鍵問題。

Artemin（ARTN）是一種神經膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）家族配體，目前的研究表明，ARTN是一個癌基因，在不同的腫瘤組織中表達水平有所不同，該基因在腫瘤組織中的異常激活可能與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移相關[3]。研究表明：ARTN與非神經源性惡性腫瘤發生關系密切[4]。近年來研究發現ARTN在消化系統和呼吸系統惡性腫瘤中的表達能夠促進癌細胞的侵襲能力，進一步的研究證實ARTN是神經旁分泌的重要調控因子[5]。在生殖系統惡性腫瘤的研究中國外學者研究證實ARTN在多個乳腺癌細胞系中表達，過表達該基因的乳腺癌細胞的克隆形成能力、侵襲能力均明顯增加；高表達ARTN的患者總生存率明顯低于陰性患者，且與腫瘤的復發、遠端轉移相關[6]。在子宮內膜癌中的表達明顯高于正常的子宮內膜組織，進一步的研究表明，子宮內膜癌細胞高表達ARTN增加細胞的侵襲能力可能與AKT1表達水平的增高相關[7]。

本研究對乳腺浸潤性導管癌組織切片進行免疫組化分析發現，Artemin在有無淋巴結轉移的乳腺癌組織中表達差別明顯，有淋巴結轉移的乳腺癌組織處Artemin染色深棕黃色，預示表達水平偏高。說明Artemin的表達水平的高低與淋巴結轉移與否關系密切。這些充分印證Artemin參與腫瘤的發生和轉移。

在乳腺癌細胞系MDA231中，下調Artemin的乳腺癌細胞的遷移和定向運動能力與對照組相比明顯降低，乳腺癌細胞的趨化和粘附能力也顯著下降。siATRN-MDA231細胞穿透matrigel膠的能力明顯低于對照組，與對照組相比侵襲能力下降了76.5%（P＜0.01）。表明Artemin對乳腺癌的侵襲和轉移作用是不可或缺的。

乳腺癌發病機制主要涉及腫瘤細胞的粘附、遷移、細胞外基質降解、新生血管形成及癌基因和腫瘤抑制基因的異常表達等方面。癌細胞基因調控存在于染色體水平、轉錄水平、翻譯水平中一個或多個層次，其中以轉錄水平的調控最為重要。ATRN在乳腺癌侵襲轉移中的作用，國內尚少見報道。本研究試圖從ATRN角度探索其與乳腺癌侵襲轉移的關系，為遏制乳腺癌發生提供一些有價值的信息。