肺鱗癌中miR-144靶基因預測及其生物信息學分析

李偉，王兆松，董秋萍，徐玥，陳永孜，許世磊

（天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

肺鱗狀上皮細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LSCC）是原發性肺癌中常見的一種[1]，但其對放療、化療不敏感[1-2]。因此找到更好的治療靶點，對于治療肺鱗癌具有重要的意義。已有研究表明，HsamiR-144可以通過調控TIGAR基因來抑制肺癌的增殖并誘導肺癌細胞的凋亡和自噬[3]，miR-144可以通過影響GLUT1影響腫瘤的代謝[4-7]，還可以通過AP-4影響非小細胞肺癌的轉移[8]。miR-144影響腫瘤的研究中往往只針對其中一個靶基因，而miRNA在細胞中通常會調控多種靶基因，目前對于肺鱗癌相關miR-144靶基因綜合的研究還未見報道，本文采用多種生物信息學的手段，綜合分析了miR-144的靶基因及其相關的一些生物學特征信息，并依據TCGA中肺鱗癌患者的數據，深入分析了miR-144靶基因的相關信息，以期為其在肺鱗癌治療方面的作用提供理論支持[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數據材料 通過網站 UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/datapages/）下載已經標準化處理的TCGA數據庫中肺鱗狀細胞癌患者數據（更新時間2016年4月）。

1.1.2 分析軟件及數據庫 SPSS 19.0統計分析軟件，GraphPad Prims 7統計分析軟件，Cytoscape 3.5.0系統生物學分析軟件（http：//www.cytoscape.org/）；miRNA 靶基因數據庫 Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、TargetMiner （http：//www.isical.ac.in/～bioinfo_miu/targetminer20.htm）、miRDB（http：//www.mirdb.org/miRDB/）、PicTar （http：//pictar.mdcberlin.de/）；靶基因綜合分析網站 Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；DAVID信號通路分析網站（https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.2 方法交叉表分析肺鱗癌患者 miR-144表達量與性別、年齡的相關性，并分析表達量與總生存率（overall survival，OS） 間關系并作圖；通過Targetscan、Targetminer、miRDB 和 PicTar數據庫預測miR-144靶基因，利用Venny 2.1軟件綜合分析4個數據庫的結果并預測得到miR-144的候選靶基因；使用GraphPad Prims 7軟件對患者的癌與癌旁組織基因表達數據進行配對樣本t檢驗，分析靶基因在組織間的表達差異；使用BinGo插件對靶基因進行GO（gene ontology）富集分析；DAVID分析靶基因參與的信號通路。

2 結果

2.1 miR-144與患者總生存率間關系 下載并篩選出458例TCGA中收錄了miR-144的表達量及OS的肺鱗癌病例。簡單整理數據發現，458例患者中miR-144的最高表達量10.19，最低表達量為2.29，中位數為 6.277，均值為 6.256，方差為 2.163。以其表達量中位數（6.277）為界限分為高表達組（共229例）和低表達組（229例）。年齡方面，40歲為其最低年齡，90歲為最大統計年齡，年齡中值為68歲，平均年齡67.55歲，方差73.612，按其中位數將所有統計患者分為低齡和高齡兩組，交叉表分析發現miR-144表達量與患者年齡無必然聯系（P＞0.05）。從性別方面分析，所有統計患者中，男性有338例，女性患者120例，交叉表分析發現miR-144表達量與性別也無必然聯系（P＞0.05），具體結果見表1。

表1 肺鱗癌患者miR-144表達量與年齡、性別交叉表分析Tab 1 Cross-Tabulations analysis of miR-144 expression level and age,gender in patients with lung squamous cell

SPSS繪制miR-144表達量與總生存率的生存函數，分析發現miR-144高表達組的總生存率比低表達組的高，且P=0.003（小于0.05），生存函數圖如圖1所示。因此miR-144的高表達有利于延長肺鱗癌患者的總生存時間，并且這種影響與患者的年齡和性別無關。

圖1 肺鱗癌患者miR-144表達量與總生存率分析Fig 1 MiR-144 expression and overall survival(OS)analysis in patients with lung squamous cell

2.2 miR-144在肺鱗癌患者與其正常組織間表達差異分析 對TCGA中的肺鱗癌患者數據進行分析篩選，得到了43例即收錄了癌組織又收錄相應的癌旁正常組織表達信息的患者，這43例癌組織的hsa-miR-144的表達均值為6.248 6，最大值為9.810 2，最小值 2.294 7，方差為 2.328 0；癌旁組織的hsa-miR-144的表達均值為9.517 2，最大值為12.085 4，最小值5.244 0，方差為1.806 4。使用GraphPad Prism 7對43對數據進行配對樣本的t檢驗分析，得到如圖2所示的點狀圖，腫瘤組織中miR-144的表達量遠低于癌旁正常組織，并且其P＜0.000 1，提示miR-144的表達對于腫瘤的發生發展具有十分重要的意義。

圖2 肺鱗癌患者癌與癌旁miR-144表達量分析（****：P＜0.000 1）Fig 2 Expression analysis of miR-144 in tumor and normal tissue from patients with lung squamous cell carcinoma(****：P＜0.000 1)

2.3 miR-144靶基因的預測 通常一個miRNA調控多靶基因的表達，不同數據庫的預測會得到不同的結果，為了能準確地預測，綜合多個數據庫的預測結果，并將每個數據庫中均出現的基因作為最終候選靶基因。

本 文 采 用 Targetscan、miRDB、Targetminer 和PicTar4個數據庫預測miR-144靶基因，分別得到了1043、569、2228和397個靶基因。通過在線綜合分析工具Venny 2.1綜合分析并最終得到了一個共有72個基因的集合，如圖3所示，這個集合中包括了 ABCA1、CAV2、HOXA10、MOB2、SS18、ZFX 等基因，因此，可以認為這72個基因是miR-144的候選靶基因。

2.4 肺鱗癌患者中miR-144靶基因的表達差異分析 分析肺鱗癌患者的癌與癌旁組織間所有靶基因的表達，通過表達差異分析，確定有顯著性差異的基因為miR-144影響肺鱗癌進展的靶基因。篩選得到了TCGA數據庫中36例肺鱗癌患者的配對表達數據，這些數據包含癌與癌旁組織的所有RNA測序數據，并已進行標準化處理。36例患者癌和癌旁正常組織的72個候選靶基因表達數據主要包括每個基因在癌與癌旁正常組織的極值、均值、方差。使用GraphPad Prims對上述72個基因在不同組織的表達進行配對樣本的t檢驗，其中在腫瘤組織和配對的正常組織中表達具有明顯的差異（P＜0.05）有45個基因，其中在癌旁組織中高表達的有30（66.67%）個，15（33.33%）個基因在腫瘤中高表達，見表2。

圖3 miR-144靶基因分析示意圖Fig 3 Illustration of miR-144 target gene analysis

表2 癌與癌旁正常組織miR-144靶基因表達差異情況Tab 2 The different expression of miR-144 target gene in tumor and normal tissue

2.5 miR-144靶基因GO注釋分析 基因本體論（gene ontology，GO）是通過對基因及其產物在細胞中參與的生物學過程、組成成分以及分子功能對基因及產物進行描述。為進一步分析miR-144的靶基因在肺鱗癌發生發展中的作用，對篩選出的45個差異表達的靶基因通過分析軟件Cytoscape的BiNGO插件進行GO注釋富集分析，設置物種為人類（Homo sapiens），差異水平 0.05，注釋文件選擇所有（All）。結果顯示可知，從細胞組成方面看部分靶基因參與細胞核以及星形微管、細胞質中顆粒等的組成。這些基因參與包括肌肉形成、胚胎發育、神經元遷移、上皮細胞增生、RNA轉錄等等多達50項生物學過程，另外還參與了代謝過程。從參與的分子學過程看主要行DNA結合功能，這有利于其參與RNA轉錄的過程，另外還有一些蛋白質的結合功能。2.6 miR-144靶基因KEGG通路分析 通過GO富集分析對miR-144靶基因的功能進行初步解析，但基因通常是通過參與機體的信號通路對生命活動進行調節的，本文通過DAVID對45個候選靶基因進行信號通路分析。其中16個靶基因參與了多達37個信號通路，FBXW11參與了7個信號通路，包括蛋白質泛素化降解，Wnt信號通路，Hedgehog信號通路，Hippo信號通路等，其中Wnt和Hippo信號通路對腫瘤的發生發展具有重要的影響。ETS1，CAV2參與的信號通路對腫瘤的遷移侵襲具有重要影響。

3 討論

本文對miR-144的靶基因進行生物信息學分析，并聯系肺鱗癌患者的臨床及基因表達數據，以期能夠對臨床研究提供指導意義。一個miRNA往往會調控多個靶基因表達，筆者發現miR-144共有72個候選靶基因，其中45個在肺鱗癌患者癌與癌旁正常組織間表達差異明顯。

GO富集分析發現miR-144靶基因的產物參與細胞核組成，另外還與星形微管、細胞質中顆粒形成有關。miR-144與肌肉的形成、個體胚胎發育、上皮細胞增生、RNA轉錄等生物學過程有關，其靶基因還參與了人體的新陳代謝過程[10-12]。分子功能中DNA結合，蛋白質結合等功能，都有利于其參與相應的生物過程[13-14]。

miR-144靶基因的KEGG通路分析可幫助我們更好地了解其在生命活動中參與的信號通路。miR-144可以通過影響Ras信號通路、Wnt信號通路、Hippo信號通路等調控肺鱗癌的發生發展[15-16]，當miR-144的表達發生變化時，整個細胞中基因的表達發生變化，一系列的信號通路也隨之變化，進而影響了腫瘤的進展過程。miR-144在正常組織中表達量高于癌組織，且其高表達可有效延長肺鱗癌患者的總生存時間，因此，綜合分析miR-144靶基因的相關信息，可為深入研究其在肺鱗癌患者中的作用機制提供重要理論數據支持。