HPV E6/E7 mRNA與YAP在宮頸癌中的表達與相關性研究

李 娜，李洪林，尹利榮

（天津醫科大學第二醫院婦科，天津300211）

宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌，居世界第二位，嚴重威脅婦女的生命健康[1]。眾所周知，宮頸癌由宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN) 發展而來，宮頸癌的發生發展是一個漫長的過程，宮頸上皮內瘤變（CIN）即為宮頸癌前病變[2]，從CIN發展到宮頸癌大約是10年的時間。早期宮頸癌患者5年治愈率高達90%，因此，CIN的早期診斷治療對降低宮頸癌的發生率和死亡率至關重要。目前，宮頸癌的發病機制越來越受到國內外學者的關注，成為研究熱點。大量研究表明，人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌發生的主要原因，特別是高危型HPV感染。高危型HPV的E6、E7蛋白在腫瘤的發生發展中起重要作用。超過90%的浸潤性宮頸癌都能檢測到HPV感染，甚至95%的癌前病變患者攜帶HPV，HPV感染是宮頸癌的主要致病因素，但只有很少病例最終發展到浸潤性宮頸癌。因此，HPV感染雖是細胞惡性轉化的重要致病因素，但還有其它致病因素存在，才能最終發展到宮頸癌。近年來發現，Hippo信號通路與腫瘤的發生密切相關，YAP作為該通路重要的效應因子可以誘導細胞增殖并抑制凋亡。但目前在宮頸癌中關于HPV感染與YAP表達的相關研究報道較少，對于兩者在宮頸癌的發生中是否存在協同作用尚不清楚，因此本文通過研究宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA與YAP的表達情況，探討兩者在宮頸癌發生中的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2014年6月-2015年6月在我院婦科就診后行手術治療的患者124例，其中將行宮頸錐切病理診斷為CINII-III的45例患者歸為CIN組，將病理診斷為宮頸癌并行廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結清掃術的43例患者歸為宮頸癌組。按WHO組織病理學分類，其中鱗癌29例，腺癌14例；宮頸癌分期采用國際婦產科聯盟（FIGO）2009年的診斷標準，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期18例；按腫瘤分化程度進行分級：高分化16例，中分化18例，低分化9例；盆腔淋巴結轉移情況：有轉移22例，無轉移21例。對照組36例選自同時間段在我院因子宮良性病變（子宮肌瘤以及腺肌癥后行宮頸活檢的病例）行子宮全切術的正常宮頸標本，術后經病理證實無宮頸病變。對照組年齡26～56歲，平均年齡為（43.58±8.476）歲，中位年齡 45歲；試驗組年齡18～72歲，平均年齡（46.65±11.623）歲，中位年齡46歲，兩組年齡比較無統計學差異（P＞0.05)。所有病例排除生殖道急性炎癥，排除合并其他惡性腫瘤以及已行放化療的宮頸癌組織標本，臨床及病理資料完整。

1.2 試劑及儀器 宮頸穩態試劑盒及96孔檢測板[科蒂亞（新鄉）生物技術有限公司]；Quanti VirusTM臺式冷光儀；恒溫箱（型號QS071）；兔抗人YAP多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）；生物素標記的抗兔IgG（二抗）（北京中杉金橋生物技術有限公司）；SP試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HPVE6/E7 mRNA的檢測 （1）標本采集：使用液基細胞學Autocyteprep系統專用刷插入受檢者子宮頸旋轉8～10圈，收集宮頸口及頸管脫落上皮細胞，然后將刷頭部放入裝有CytoRich保存液的小瓶內供HPVE6/E7 mRNA檢測。（2）實驗步驟：將液基細胞學標本放入離心管水平離心2次（3000r/min，5 min），使標本同質化。加入600 μL細胞裂解液和5 μL蛋白酶K，吹打混勻，放入65℃恒溫箱1 h，中間取出標本管振蕩2～3次，使細胞充分裂解，待測。按照宮頸穩態試劑盒說明書操作及配置相關溶液并布板，其中陽性對照液，空白對照液均做復孔。經過信號放大，加入標記熒光物質的底物后，在冷光儀上檢測。檢測結果為光子數，經計算軟件轉換為拷貝數。本研究以mRNA拷貝數≥1 copy/mL為陽性。

1.3.2 YAP的檢測 通過預實驗取最佳一抗工作濃度1：200進行試驗，按常規步驟通過免疫組化SP法檢測正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤樣病變和宮頸癌組織中YAP的表達情況。所有操作步驟依據產品說明書進行，二抗為生物素標記的抗兔IgG，用二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、干燥、封片，顯微鏡下觀察分析結果。已知陽性組織片做陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。每例常規進行HE染色。

1.4 結果判讀 所有切片的觀察均經2～3名病理科醫生獨立在光鏡下完成。YAP免疫組化染色結果判定：以胞漿和胞核中出現棕黃色顆粒或者棕褐色顆粒為陽性。每例均隨機觀察5個高倍視野（×400），用半定量積分法判斷結果，染色陽性細胞所占比例按以下標準計分：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為 1分，26%～50%為 2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度計分以細胞顯色反應程度計分：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后將陽性細胞所占的百分比分值和染色強度分值相乘為結果：0～2分為陰性，3分及以上為陽性。

1.5 統計學方法 所有實驗數據資料均采用SPSS17.0統計軟件進行分析，應用χ2檢驗分析HPV E6/E7 mRNA和YAP在不同宮頸組織中的表達情況，并分析YAP的表達與宮頸癌臨床病理參數之間的關系，采用Spearman等級相關檢驗分析HPV E6/E7 mRNA與YAP的相關性，數據以檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA的檢出情況 HPV E6/E7 mRNA的陽性檢出率隨著宮頸病變程度的升高而逐級升高（正常組16.67%、CIN組82.22%、宮頸癌組88.37%），3組比較差異具有統計學意義（P＜0.001）。正常組與CIN組、正常組與宮頸癌組組間差異具有統計學意義（P＜0.05），CIN組和宮頸癌組，組間無明顯差異（P＞0.05），見表1。

2.2 不同宮頸組織中YAP的表達情況 免疫組化染色結果顯示，YAP表達以胞核為主，在胞質中部分表達。YAP在正常組中的表達明顯低于CIN組及宮頸癌組，3 組之間比較，χ2=66.193，P＜0.001，差異具有統計學意義（P＜0.001）。再兩兩之間進行比較，發現正常組與宮頸癌組、正常組與CIN組兩兩比較差異具有統計學意義（P＜0.05），但CIN組與宮頸癌組之間比較無明顯統計學意義（P＞0.05），見表2、圖1。

表1 各組HPV E6/E7 mRNA檢出情況Tab 1 The positive rate of HPV E6/E7 mRNA in each group

表2 各組YAP的表達情況Tab 2 The expression of YAP in each group

圖1 YAP在正常宮頸、CINII-III、宮頸鱗癌組織中的表達（免疫組化法，×400）Fig 1 Expression of YAP in normal cervical tissues,CINII-III and cervical squamous cell carcinoma（IHC，×400）

2.3 YAP的表達與宮頸癌臨床病理參數間的關系 在宮頸癌組織中，YAP在有淋巴結轉移組中的表達明顯高于無淋巴結轉移組（P＜0.05），而與宮頸癌的臨床分期（I、II期）、組織學分級以及組織學類型無相關性（P＞0.05)，見表 3。

2.4 HPV E6/E7 mRNA與YAP表達的相關性分析 經Spearman等級相關分析，宮頸癌組織HPV E6/E7 mRNA和YAP表達具有正相關性，r=0.383，P=0.011，見表 4。

表3 YAP的表達與宮頸癌臨床病理參數的關系Tab 3 The relationship between the expression of YAP and clinical pathological parameters of cervical carcinoma

表4 HPV E6/E7 mRNA與YAP在宮頸癌中表達的相關性Tab 4 The correlation between the expression of HPV E6/E7 mRNA andYAPincervialcarcinoma

3 討論

3.1 HPV E6/E7與宮頸病變的關系 HPV致癌的主要環節就是高危型HPV16、18編碼的E6、E7致癌蛋白分別與抑癌基因p53和pRb結合，使p53通路和Rb通路失活，導致細胞周期調控異常，引起宮頸癌的發生。子宮頸的鱗狀上皮和柱狀上皮交界處是HPV的易感部位。HPV感染宿主后，HPV DNA與宿主染色體進行整合。HPV與宿主細胞染色體的整合是宮頸細胞永生化過程中的重要步驟，是導致宮頸上皮內瘤變向宮頸癌惡性進展的一個重要標志[3]。由于E2基因不穩定，HPV DNA與宿主細胞的整合常引起E2基因的缺失，E6、E7的轉化作用受E2的調控，E2片段缺失可導致E6和E7基因表達失控，通過干擾細胞周期調節和有絲分裂，引起細胞轉化和癌變發生。本研究結果提示，隨著宮頸病變級別的升高，HPV E6/E7 mRNA的陽性檢出率逐級升高，正常組、CIN組、宮頸癌組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示，HPV E6/E7 mRNA 是宮頸癌發生發展的重要因素。因此，HPV E6/E7 mRNA的檢測，對于及時發現、干預宮頸癌的發展、協助臨床診斷、指導預后均具有重要的意義。

3.2 YAP與宮頸病變的關系 Hippo通路在通過抑制細胞增殖和促進凋亡來調控器官大小和腫瘤的發生中起著關鍵的作用。YAP最初由Sudol[4]于1994年發現，是一種細胞內轉錄共激活因子和連接蛋白，參與調控細胞生長、增殖和凋亡。YAP基因定位于染色體11q22[5]，編碼相對分子量約65kda富脯氨酸的鱗蛋白，被認為是一種有效的致癌基因和Hippo信號通路的核效應器，通過增強轉錄因子的活性促進基因表達。YAP在正常組織中表達很低，可維持細胞生長、分化、凋亡的穩態平衡。如果任一環節突變，惡化的細胞表達過量的YAP，超過正常生理調控功能，導致YAP在胞質內異常聚集，并不斷向核內轉移，激活下游靶基因，有利于腫瘤的發展、惡化。大量研究表明，Hippo-YAP信號轉導通路與人類腫瘤發生發展關系密切[6]，許多腫瘤中染色體擴增區域都含有YAP基因，并且YAP在正常組織和惡性腫瘤中的表達存在明顯差異，多數癌組織中的表達較對照組明顯升高，并呈上升趨勢。在胰腺癌[7]、胃癌[8]、肝癌[9]及非小細胞肺癌[10]中，YAP 表達量均明顯高于正常組織，說明YAP在惡性腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用。Liu等[11]應用免疫組織化學方法檢測120例鱗狀細胞癌、42例腺癌、22例正常宮頸組織YAP的表達水平，并對細胞質與細胞核中YAP的表達單獨分析，發現YAP在腫瘤中的表達水平明顯高于正常組織。研究證明了YAP在宮頸癌的致癌潛能及其在鱗狀細胞癌和腺癌中的獨特功能。

本實驗結果顯示：YAP在正常組、CIN組以及宮頸癌組中的表達呈上升趨勢，且差異具有顯著性（P＜0.05），可以推斷出YAP的表達可能參與了宮頸癌的發生過程，并且YAP有可能在宮頸癌的臨床診斷中具有重要價值。本實驗的結果和YAP在其他大部分腫瘤中的報道是一致的。在宮頸癌組織中，YAP在有淋巴結轉移組中的表達明顯高于無淋巴結轉移組（P＜0.05），而與宮頸癌的臨床分期（I、II期）、組織學分級以及組織學類型無相關性（P＞0.05)，提示YAP在宮頸癌的浸潤轉移中起著重要的作用。YAP可作為判斷宮頸癌生長、浸潤以及轉移能力的指標，對腫瘤進展的輔助診斷以及預后評估是非常有幫助的，YAP的表達越高，宮頸癌的惡性侵襲性越強、病情進展越快，說明了YAP的擴增、突變可能促進了宮頸癌的侵襲和轉移。

3.3 HPV E6/E7 mRNA與YAP的相關性 研究表明YAP與HPV都與p53家族相關聯。P53是一種應激激活的轉錄因子，防止基因受損細胞的增殖。p53基因是一種調節細胞程序性死亡和細胞周期相關途徑的關鍵調節因子，激活細胞周期檢查點和促進細胞衰老，它已被認為是腫瘤抑制的主要參與者。p53損失或失活促使異常細胞克隆擴增，導致基因組不穩定。高危型HPV的癌蛋白E6和E7通過干擾p53途徑實現宮頸細胞轉化和永生化。YAP通過調節p53活性來控制轉錄。已發現YAP與p73和p63通過WW結構域和PPPY結構相結合，p73和p63為p53腫瘤抑制家族的新成員。此外，Xiao等[12]應用免疫組化的方法檢測慢性炎癥組、CIN組、宮頸癌組YAP的表達，用HPV基因檢測試劑盒檢測各組HPV的感染率，結果表明，YAP與HPV檢測相結合，可以區別宮頸癌前病變和良性病變。

綜上所述，本研究發現YAP可作為宮內上皮內瘤變和宮頸癌的預測標志物。聯合檢測HPV和YAP可以提高宮頸病變的診斷率，通過早期干預從而降低宮頸癌的患病率。