一種簡易的細胞煙草煙霧暴露裝置的構(gòu)建

李夢鴿，毛建文

吸煙或二手煙是慢性支氣管炎、肺氣腫和慢性氣道阻塞的主要誘因之一。吸煙可引起中央性及外周性氣道、肺泡及毛細血管結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，同時對肺的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致肺部疾病的產(chǎn)生。在研究吸煙與肺部疾病的關(guān)系中，有體內(nèi)實驗和體外實驗兩種方式：體內(nèi)實驗主要為動物模型，體外實驗主要為細胞模型。在體外實驗中，人肺細胞可以接受適當(dāng)劑量煙草煙霧的處理，用來研究煙草煙霧對細胞的影響并探討其機制。經(jīng)典的體外模型是將煙草提取物加入細胞培養(yǎng)基作用于細胞即浸沒式細胞培養(yǎng)方法。已有大量的研究利用這種方法研究煙草對多種氣道細胞和呼吸系統(tǒng)的影響及機理[1-7]。然而，浸沒條件下的煙草煙霧暴露并不能真實地反映出吸煙者吸煙或吸入二手煙時體內(nèi)細胞發(fā)生的暴露條件。為了盡可能接近氣道或肺細胞在空氣-液體界面暴露于煙草煙霧的情況，一些公司和研發(fā)機構(gòu)近些年研發(fā)出新型全煙霧曝露體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，此類系統(tǒng)以產(chǎn)生煙草煙霧并將全煙煙霧輸送到體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的毒理學(xué)和生物學(xué)評估，包括Cultex公司的香煙煙霧細胞暴露系統(tǒng)、英美煙草曝露室（British American Tobacco’s(BAT)exposure chamber）[8-9]和 Borgwaldt RM20S 吸煙機[10-11]。 這些儀器具有全自動定量產(chǎn)生香煙煙霧，高通量等特點，但此類儀器價格昂貴，不便于探索性研究。為了滿足小型實驗室研究所需，根據(jù)該類儀器的原理，該次在2017年3月份構(gòu)建了一個簡易版的細胞煙草煙霧暴露室，并通過檢測煙草煙霧暴露對氣管上皮細胞自噬的影響驗證了其可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

HBE細胞來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠贈；高糖DMEM、FBS胎牛血清購自Gibico公司；LC3B抗體、GAPDH抗體、DAPI染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；transwell小室購自Corning公司；Dylight 488 Conjugated Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)購自 Abbkine 公司；固定液、免疫染色封閉液、抗熒光淬滅劑購自碧云天生物技術(shù)公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自博士德生物工程有限公司，雙圈定性濾紙購自杭州沃華濾紙有限公司,脫脂奶粉、注射器購自廣州翔博生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞免疫熒光

與煙草煙霧作用后的細胞吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次后，加固定液固定15 min后，吸除，用PBS洗3次，加免疫染色封閉液封閉1 h，吸除后加入 LC3B抗體（1∶100），4℃孵育過夜。吸除抗體后，PBS洗3次，加入熒光二抗，孵育1 h，吸除后 PBS洗 3次，加入DAPI，3 min后吸除，PBS洗3次，加入抗熒光淬滅劑后封片。隨后置于ZEISS熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白的變化，提取與煙草煙霧作用后細胞的總蛋白，用BCA法測得蛋白樣品的濃度，計算蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后，TBS/T洗3次，用奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗3次后加入一抗（LC3B，1∶1 000；GAPDH，1∶1000)，4℃孵育過夜。 吸除一抗后，TBS/T洗3次，加入相對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。TBS/T洗3次后，顯影、定影。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果使用Image J進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Graphpad Prism5軟件進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 煙草煙霧暴露裝置的構(gòu)建及暴露方法

利用transwell小室的半透膜來達到承接的目的，使細胞在接觸培養(yǎng)基保持生存狀態(tài)的同時，又能暴露在煙草煙霧中，與煙草煙霧相互作用。細胞煙草煙霧暴露裝置如圖1所示;在一個干凈的容器底部放置浸滿培養(yǎng)基的濾紙，把有細胞生長的transwell小室放在濾紙上以保持細胞生長在一個濕潤的環(huán)境中，用注射器吸取煙草煙霧之后注入transwell小室中，使得細胞能夠充分接觸煙草煙霧，煙草煙霧暴露裝置和暴露過程是在通風(fēng)櫥中進行的，為便于煙霧吸出。

①種板：兩個transwell小室，每個小室種50萬個HBE細胞，細胞第2天備用，其中一個為實驗組，一個為正常對照組。②將泡過酒精的注射器、管子、放置transwell小室的容器照紫外殺菌。③在容器底部放兩層浸滿培養(yǎng)基的濾紙，按照圖1所示放入transwell小室。④用注射器吸取煙草煙霧通過管子注入transwell小室中。⑤煙草煙霧與細胞的作用時間為30 min[10]。⑥作用結(jié)束后，用PBS洗滌3次后，放入37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

圖1 細胞煙草煙霧暴露裝置示意圖

2.2 煙草煙霧暴露致HBE細胞自噬體增加

自噬體是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分所形成的。LC3蛋白首先會在合成后立即在其羧基端被Atg4(酵母蛋白)所剪切，產(chǎn)生細胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7(酵母蛋白)和Atg3(酵母蛋白)在內(nèi)的泛素樣體系所修飾和加工，并定位到自噬小體中。這樣，自噬小體中存在的LC3，和低分子量的LC3-II都被當(dāng)做細胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志，LC3B作為LC3的一種，可以用作自噬的分子標(biāo)志。由圖2結(jié)果顯示：煙草煙霧組的自噬體數(shù)量較多且自噬體比較聚集，而正常對照組的自噬體幾乎沒有且較彌散。煙草煙霧組和正常對照組相比，自噬體明顯增多。

圖2 煙草煙霧暴露對LC3B表達分布的影響

2.3 煙草煙霧暴露致HBE細胞LC3BII/LC3BI比值上升

LC3是自噬標(biāo)志物，自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可評估自噬水平的高低。LC3B作為LC3的一種，可以用作自噬的分子標(biāo)志，LC3BII和LC3BI的比值作為自噬強弱的指標(biāo)，比值越大，表示自噬越強。圖3結(jié)果顯示：煙草煙霧組的LC3BII/LC3BI的比值明顯大于正常對照組提示煙草煙霧暴露促進了HBE細胞的自噬。

圖3 .煙草煙霧暴露對LC3B蛋白表達的影響

3 討論

長期吸煙或二手煙可引起各種肺部炎癥和肺纖維化，直至誘發(fā)肺癌。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，因此煙草煙霧暴露與肺部疾病關(guān)系的研究一直是研究重點。一直以來，將煙草提取物加入培養(yǎng)基的浸沒式培養(yǎng)法是研究煙草對氣道和肺細胞作用的主要方法，但該方法的缺點是作用條件與體內(nèi)條件差異較大。近年基于空氣-液體界面原理，裝配有全自動吸煙裝置的香煙煙霧細胞暴露系統(tǒng)被開發(fā)出來，這些暴露系統(tǒng)和傳統(tǒng)的浸沒式暴露方法相比具有更大的生理意義，在空氣-液體界面下培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物并使細胞暴露于兩相的同時接受煙草煙霧的作用，來捕獲兩者之間的相互作用。但該系統(tǒng)價格昂貴，不適合小型實驗室或探索性研究用。該研究基于該系統(tǒng)的原理，利用transwell小室、六孔板、注射器、濾紙和硅膠管等成功構(gòu)建了簡易的細胞煙草煙霧暴露裝置。該裝置材料來源容易，價格低廉，構(gòu)建方法簡單，適合小型實驗室及探索性研究煙草煙霧暴露對氣道或肺細胞影響的研究。

細胞內(nèi)的物質(zhì)主要有兩種降解途徑，一種是通過蛋白酶體被降解，另一種是通過自噬作用。正常生理條件下，細胞內(nèi)保持一個低的基礎(chǔ)自噬水平，但是當(dāng)細胞在營養(yǎng)能量缺乏、氧化應(yīng)激、感染等情況下，自噬水平會迅速被上調(diào)[12]。自噬提供了細胞維持體內(nèi)平衡和適應(yīng)不利環(huán)境的基本功能[13-15]。LC3在自噬前體和自噬體的膜上特異性表達，由于可被酸性水解酶降解，LC3在自噬溶酶體存在較少。在哺乳動物細胞內(nèi)LC3B的總量不會有較大的波動，在自噬增加時會出現(xiàn)LC3B-I向LC3B-II進行轉(zhuǎn)換。一些學(xué)者的研究證明，煙草煙霧可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬[16-17]。該研究利用構(gòu)建的簡易煙草煙霧暴露裝置，將HBE細胞置于煙草煙霧暴露后，利用細胞免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測LC3B的表達分布及LC3BII/LC3BI比值的變化，觀察煙草煙霧暴露對HBE細胞自噬的影響，結(jié)果顯示煙草煙霧明顯促進HBE細胞的自噬，說明設(shè)計的簡易版煙草煙霧暴露室可以用于煙草煙霧與細胞作用及其機理探索的研究。

綜上所述，該研究利用簡單易得的材料設(shè)計了簡易的煙草煙霧暴露裝置，該裝置可以用于煙草煙霧暴露對與氣道或肺細胞影響和機理的研究，且該裝置具有材料簡單，制作簡易、價格低廉等優(yōu)點。