甲狀腺乳頭狀癌組織中mTOR的表達及其臨床意義

閆斌 ,徐殿新 ，韓麗紅，于躍利

近年來我國甲狀腺癌的發(fā)病率有明顯上升趨勢，以沿海城市為甚，超過了其他惡性腫瘤的增長速度，對人類危害極大。甲狀腺乳頭狀腺癌的研究水平日漸深入，尋找具有特異性的甲狀腺癌相關的腫瘤標志物對甲狀腺乳頭狀腺癌的早期診斷，術前診斷，以及進一步探討其發(fā)生、發(fā)展及預后具有重要的意義，而且為甲狀腺乳頭狀腺癌的治療提供新的方向。隨著腫瘤分子生物學研究不斷的發(fā)展，靶向治療研究的不斷進步，能夠推測mTOR在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所能起到的作用變得尤為重要[1-5]。但mTOR與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展的關系，目前在國內相關研究尚屬于空白，未見相關報道。針對這一現狀選擇2014年3月—2016年2月于包頭市腫瘤醫(yī)院經手術根治切除的甲狀腺乳頭狀癌標本，分別對60例甲狀腺乳頭狀癌、30例甲狀腺良性病變中mTOR的表達情況以及mTOR與甲狀腺乳頭狀癌的相關性作了初步的研究。現將結果總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗標本材料選自內蒙古包頭市腫瘤醫(yī)院 （包頭市第七醫(yī)院）頭頸外科及普外科術后常規(guī)病理組織標本（病理科甲狀腺病變存檔蠟塊，患者家屬及委托人術前均簽署手術切除標本病理檢查同意書），其中包括60例甲狀腺乳頭狀癌標本，30例甲狀腺良性病變標本（甲狀腺腺瘤標本15例，結節(jié)性甲狀腺腫標本15例）。甲狀腺乳頭狀癌患者的年齡范圍是16～72歲，甲狀腺良性病變患者的年齡范圍是27～69歲。所有標本均為外科手術切除，具體臨床資料見表1、表2。甲狀腺乳頭狀癌組標本選擇時標本所屬患者在采取甲狀腺組織的采樣 （甲狀腺根治性切除治療）前均未行相關藥物治療、化療、放療等。甲狀腺標本采集后送病理科行石蠟包埋制備，并切片行病理學診斷，均經病理證實為甲狀腺乳頭狀癌，不限制分期。甲狀腺良性病變組標本選擇時經病理科病理診斷證實為非正常甲狀腺組織的。

1.2 方法

1.2.1 檢測 該次實驗全部標本經過充分的浸泡固定，取材，常規(guī)石蠟包埋。標本經5μm連續(xù)切片，60℃烘烤過夜，分別做HE和免疫組化染色。免疫組化染色采用Evision法，mTOR mAb采用1：100稀釋。具體過程如下：將切片放置于37°C溫箱內1 h。將切片經二甲苯兩道，每道15 min，脫蠟處理。將切片經酒精三道，每道5 min，脫二甲苯處理，水化，制成切片備用。將已經沖洗完成的組織切片擦拭干凈后，每張切片上加入第一抗體，放于濕盒內，并于37°C溫箱中將組織切片孵育1 h。使用磷酸鹽緩沖液充分沖洗切片。每張組織切片上加入第二抗體后，將組織切片放于濕盒內，然后置于溫箱40～60 min。再次使用磷酸鹽緩沖液充分沖洗切片。使用1 mL蒸餾水分別加入DAB顯色液各1滴，以配制顯色劑。染色劑配制完畢后，將顯色劑均勻的滴加于組織切片上，約4～8 min，并于顯微鏡下監(jiān)控顯色情況，使用蒸餾水終止顯色。將顯色的組織切片于蘇木精中1～2 min復染，使用鹽酸酒精酸化，然后使用氨水藍化。藍化完成，將組織切片置于兩道酒精5 min/次，二甲苯兩道10 min/次。最后使用樹脂膠封片。

表1 實驗中甲狀腺乳頭狀癌標本患者的臨床資料統計

表2 實驗中甲狀腺病變（良性）標本患者的臨床資料統計

1.2.2 染色結果的判定 采用雙盲法讀片，由兩位具有多年病理科工作經驗的病理科醫(yī)生進行讀片，每張組織切片選擇不少于10個具有代表性的高倍鏡視野。參照Naoki標準， 陽性細胞數 0%為 (-)，0%～20%為 (±)，20%～80%為(+)，＞80%為(++)；(-)和(±)為陰性，(+)和(++)為陽性。

1.3 統計方法

數據采用SPSS 19．0統計學軟件分析。組間陽性率比較采用χ2檢驗，計數資料采取百分比（%）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性病變的染色結果存在較為明顯的差異。在甲狀腺乳頭狀癌中，mTOR的染色陽性部分主要集中于甲狀腺乳頭狀癌細胞的細胞胞漿部分，呈棕色、彌漫性的分布于細胞胞漿當中，在對照組的甲狀腺良性病變中，染色的陽性部分主要集中于細胞胞漿，呈棕色，但比較甲狀腺乳頭狀癌細胞染色不同的是甲狀腺良性病變的染色為顆粒狀，大小不等，分布較散在如。 圖1、圖2。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌中mTOR的陽性表達（左圖：×100，右圖：×400）

圖2 甲狀腺良性病變中的mTOR的陽性表達（左圖：×100，右圖：×400）

該次實驗中的60例甲狀腺乳頭狀癌細胞中，mTOR在甲狀腺乳頭狀癌60例患者中的陽性表達的例數為54例，甲狀腺良性病變30例患者中mTOR陽性表達的例數為 16 例，差異有統計學意義（χ2=15.557，P=0.000＜0.05）。詳見表3。

3 討論

現已發(fā)現，許多腫瘤均伴mTOR信號通路調控異常，與腫瘤發(fā)生密切相關的細胞生長增殖、細胞周期調控、細胞遷移等均受mTOR的調控[6-8]。該次實驗中的60例甲狀腺乳頭狀癌細胞中，陽性表達的例數為54例（陽性率為90.0%），作為對照的30例甲狀腺良性病變的細胞中，陽性表達的例數為16例（陽性率百分比為53.3%），從甲狀腺乳頭狀癌中mTOR表達的陽性率與甲狀腺良性病變中mTOR表達的陽性率上可以看出甲狀腺乳頭狀癌的mTOR表達的陽性率較高，將兩者的數據進行比較，二者差異有統計學意義。

表3 甲狀腺病變中mTOR的表達

該次的研究結果與已有的一些研究結果一致。Anna等[9]對53例甲狀腺髓樣癌標本進行免疫組化分析，結果顯示，在甲狀腺髓樣癌中PI3K/Akt/mTOR通道被激活，特別是發(fā)生在有淋巴轉移的患者中。PI3K/Akt/mTOR通路支持了甲狀腺髓樣癌細胞模型的惡性特點，并對mTOR靶向治療晚期甲狀腺髓樣癌的效果進行了肯定的推測。Tamburrino A[10]等在mTOR通路的激活與甲狀腺髓樣癌和淋巴結轉移的關系的研究中，通過免疫組化的方法對53例甲狀腺髓樣癌的染色表達進行觀察，發(fā)現PI3K/Akt/mTOR信號通路在甲狀腺髓樣癌中被激活，特別是在有淋巴結轉移的甲狀腺髓樣癌中，這一途徑維持了甲狀腺髓樣癌癌細胞的增殖，表明針對mTOR的靶向治療可能是具有一定潛力的。Saji等[11]研究發(fā)現，PI3K/Akt/mTOR信號通路在甲狀腺癌的發(fā)展和惡化中扮演了重要角色，并通過大量臨床相關數據和體外研究證明了這一結論，經對該研究進行統計分析，得出該研究能應用于臨床治療的可能性推論。二甲雙胍的抗腫瘤機制除了涉及抑制AKT/mTOR信號通路，還誘導 AMPK的活化，從而抑制 mTOR信號通路[12]。

綜上所述，mTOR信號的異常表達與甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。然而，在不同類型的癌細胞中，與mTOR相關 信 號 系 統 如 AMPK、PTEN是否參與調控該過程還有待進一步探索。如能明確上述信號分子是否參與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其具體機制，則針對其作用靶點的治療將為預防和治療甲狀腺癌提供新的思路。