可同化氮濃度對藍莓果酒生物胺及氨基甲酸乙酯的影響

雷霽卿，張放，楊金川，劉靈，馬立志，*

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；2.貴陽職業技術學院，貴州貴陽550005；3.貴州省產品質量監督檢驗局，貴州貴陽550005）

藍莓（Semen Trigonellae）又稱越橘，其果實呈藍色，VC、多酚及花色苷等營養物質含量豐富，但蛋白質含量較低[1]。隨著近年來藍莓種植面積在我國逐漸擴大，使用藍莓釀造藍莓果酒成為研發藍莓深加工產品的一個熱點，而改善由于氮缺乏而引起的酒精發酵困難是目前藍莓果酒釀造過程中急需解決的關鍵問題。

在酒精發酵過程中，酵母優先利用的氮源為銨態氮、游離 α-氨基酸（free amino nitrogen，FAN）和小分子多肽，被稱為酵母可同化氮素（yeast-assimilable nitrogen，YAN）[2-4]。過去的研究表明，低水平的 YAN（低于140 mgN/L）會降低酵母生長活性，從而導致葡萄酒發酵緩慢。為了解決這個問題，磷酸氫二銨（diammonium hydrogen phosphate，DAP）和游離 α-氨基酸（FAN）通常用作葡萄酒發酵活化劑。兩者作為直接的氮源添加劑會影響發酵過程中氨基酸代謝，從而導致生物胺、氨基甲酸乙酯、高級醇等發酵產物的含量受到影響[5-7]。生物胺不僅是評估果酒新鮮度和質量的指標，高含量生物胺可能會引起不良生理影響，如頭痛，低血壓，水腫和心悸等[8]，高濃度氨基甲酸乙酯則會導致胃腸道疾病并有致癌風險[9-10]。因此，這些副產品的產生在釀造過程中非常重要。本研究采用貴州麻江種植藍莓為原料，比較不添加可同化氮果酒，添加不同濃度、不同種類可同化氮果酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量差別，以期了解補充可同化氮對藍莓果酒安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 新鮮藍莓

采于貴州省麻江縣藍莓種植基地，選取成熟度一致、大小均勻、無病蟲害、表皮無破損的藍莓果實進行果實可同化氮的測定，選取可同化氮含量最少的品種進行實驗；釀酒酵母1203：中國食品發酵工業研究所。

1.1.2 試劑

麥芽汁培養基：上海博微生物科技有限公司；焦亞硫酸鉀：上海麥克林；磷酸氫二銨、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、正丁醇、三氯乙酸：生工生物工程股份有限公司；氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯、組胺鹽酸鹽、色胺、尸胺、酪胺鹽酸鹽、苯乙胺、腐胺、精胺、亞精胺、1，7-二氨基庚烷及丹磺酰氯（標準品）、正己烷、乙腈、乙酸、乙酸胺、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷（色譜純）：美國西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；氨比色分析試劑盒（K740）：BioVision，Inc.；Cleanert EC氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-25數顯酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；糖度計：日本atogo公司；氣浴恒溫振蕩器（THZ-92B氣浴恒溫震蕩搖床）：上海博迅實業有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、240-MS氣相色譜-質譜儀：安捷倫科技有限公司；Agilent J&W DB-HeavyWAX氣相毛細管色譜柱、ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總氮的測定

藍莓果實總氮的測定參照國標GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定。

1.3.2 銨態氮的測定

藍莓果實銨態氮的測定使用Ammonia Colorimetric Assay Kit K470。

1.3.3 游離氨基酸的測定

藍莓果實游離氨基酸測定參照Vilanova M等的方法進行[6]。

1.3.4 可同化氮添加方案

1.3.4.1 單添加可同化氮

藍莓果實測定游離氨基酸與銨態氮濃度之后，選擇游離氨基酸種類及數量最少的一種果實作為發酵原料，以磷酸氫二銨（DAP）作為可同化氮源分別添加0、130、270、400、540、670、800 mgN/L 進行發酵，相應發酵果酒分別編號為FCK、F1D、F2D、F3D、F4D、F5D、F6D；以游離氨基酸（FAN）作為可同化氮源分別添加0、130、270、400、540、670、800 mgN/L 進行發酵，相應發酵果酒分別編號為 FCK、F1A、F2A、F3A、F4A、F5A、F6A；氨基酸參照藍莓果實本身所含有的種類及其比例進行添加[6]。

1.3.4.2 二次添加可同化氮的方案

一組發酵液添加DAP使其可同化氮濃度為270 mgN/L，發酵至第4天時再次添加130 mgN/L FAN使發酵液總添加可同化氮濃度達到400 mgN/L；一組發酵液添加銨態氮使其可同化氮濃度為400 mgN/L，發酵至第4天時再次添加140 mgN/L FAN使發酵液總添加可同化氮濃度達到400 mgN/L；一組發酵液添加FAN使其可同化氮濃度為270 mgN/L，發酵至第4天時再次添加130 mgN/L DAP使發酵液總添加可同化氮濃度達到400 mgN/L；一組發酵液添加FAN使其可同化氮濃度為400 mgN/L，發酵至第4天時再次添加140 mgN/L DAP使發酵液總添加可同化氮濃度達到400 mgN/L；以上4組發酵果酒相應編號為F1DA、F2DA、F1AD、F2AD；氨基酸參照藍莓果實本身所含有的種類及其比例進行添加[6]。

1.3.5 果酒發酵方法

參照張卿等[11]的方法進行酵母培養與果酒發酵。

1.3.5.1 活化酵母

將凍存酵母菌在37℃融化，接種在5°Bx的麥芽汁培養基中活化，酵母與麥芽汁培養基的比例為1∶5，放在空氣恒溫振蕩器中28℃活化3 d，然后每天進行傳代，連續3 d，使酵母處于活躍狀態。

1.3.5.2 發酵流程

選取成熟度一致、大小均勻藍莓洗凈→熱燙→勻漿→調配（pH=3.5，糖度=22°Bx）→添加偏重亞硫酸鉀滅菌→按比例接種酵母→添加可同化氮→恒溫28℃搖床培養3 d→暗處放置→過濾→酒精度與糖度的測定確定發酵結束。

1.3.6 氨基甲酸乙酯與生物胺的測定

果酒發酵14天后，放置于避光恒溫培養箱20℃低溫陳釀1個月后，測定氨基甲酸乙酯及生物胺含量。氨基甲酸乙酯含量的測定參照國標GB 5009.223-2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》。生物胺含量的測定參照國標GB 5009.208-2016《食品安全國家標準食品中生物胺的測定》。

2 結果與分析

2.1 藍莓果實總氮、銨態氮及游離氨基酸的測定

采集貴州麻將地區粉藍、園藍、燦爛共三個品種藍莓果實，進行果實總氮含量、銨態氮含量、游離氨基酸含量及可同化氮含量的測定，見表1。

由表1試驗結果可知，園藍總氮[（389.920 0±4.525 5）mgN/L]及可同化氮[（97.469 1±0.493 9）mgN/L]含量最高，但游離氨基酸含量最低[（25.125 7±0.046 6）mgN/L]，進一步測定果實中游離氨基酸種類，結果見表2。

由表2可知，3個品種藍莓果實均不含有賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro），其中，園藍藍莓果實還缺少蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）。

貴州地區藍莓果實可同化氮含量均低于100 mgN/L，因此添加可同化氮進行藍莓果酒發酵可提高發酵效率，但可同化氮含量過高會伴隨生物胺及氨基甲酸乙酯的產生。氨基甲酸乙酯是發酵過程中乙醇與尿素、瓜氨酸自發反應生成，生物胺是酵母所產生的氨基酸脫羧酶將前體氨基酸脫羧產生，兩者的產生與初始發酵液中可同化氮濃度，氨基酸種類與數量關系密切[5-6]。為進一步研究添加可同化氮種類及濃度對藍莓果酒中生物胺及氨基甲酸乙酯含量的影響，選擇氨基酸含量及種類最少的藍莓品種（園藍）作為發酵原料，采用DAP與FAN作為可同化氮源，進行果酒發酵。

表1 不同藍莓果實可同化氮含量Table1 Concentration of assimilation nitrogen in different kinds of blueberry mgN/L

表2 不同藍莓果實游離氨基酸相對含量Table2 The relative content of free amino acids in different kinds of blueberry %

2.2 可同化氮濃度對藍莓果酒氨基甲酸乙酯的影響

測定分別添加不同濃度DAP或FAN果酒中氨基甲酸乙酯含量，試驗結果如圖1所示。

隨初始發酵液中可同化氮濃度增加，果酒中氨基甲酸乙酯含量升高，DAP作為氮源的藍莓果酒中氨基甲酸乙酯生成量隨可同化氮濃度增加迅速上升，在DAP濃度800mgN/L時可達到26.5μg/L，但仍小于國家限定標準（≤30 μg/L）；添加FAN作為氮源的藍莓果酒氨基甲酸乙酯的生成量隨可同化氮濃度增加而增加（1.53 μg/L～2.359 5 μg/L）；可同化氮濃度 130 mgN/L時，DAP或FAN果酒中氨基甲酸乙酯含量差別不大，但持續增加可同化氮濃度，添加DAP果酒中氨基甲酸乙酯含量遠高于添加FAN果酒（圖1）。為進一步探索可同化氮種類及含量對氨基甲酸乙酯的影響，進行二次混合添加發酵試驗發現，二次添加可同化氮的藍莓果酒均未檢測到氨基甲酸乙酯。

圖1 可同化氮濃度對藍莓果酒氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.1 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of ethyl carbamate of blueberry wine

圖2 可同化氮濃度對藍莓果酒生物胺含量的影響Fig.2 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of biogenic amine of blueberry wine

C.Adams等采用不同酵母株接種添加不同濃度DAP的葡萄汁進行發酵后發現，可同化氮濃度對葡萄酒氨基甲酸乙酯含量的影響，取決于酵母菌株及添加可同化氮的時機：采用釀酒酵母522進行發酵，則隨著DAP濃度增高，葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量增高；采用Pasteur Red酵母進行發酵，則添加DAP反而使葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量減少；另外，采用釀酒酵母522進行發酵時，初始發酵液添加DAP的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量高于發酵開始后添加DAP的葡萄酒，采用Pasteur Red酵母進行發酵則試驗結果相反[12]。張穎等采用葡萄酒高活性干酵母進行模擬葡萄汁發酵發現添加DAP可使氨基甲酸乙酯含量降低，而添加氨基酸可使氨基甲酸乙酯含量升高[13]。本研究顯示，采用釀酒酵母1203進行藍莓果酒發酵，隨初始發酵液中可同化氮濃度升高，果酒中氨基甲酸乙酯含量隨之增加，其他酵母菌種進行發酵是否也會使添加可同化氮藍莓果酒氨基甲酸乙酯含量升高有待深入研究。

2.3 可同化氮濃度對藍莓果酒生物胺的影響

通過液相色譜測定果酒中生物胺種類及數量結果如圖2所示。

藍莓果酒生物胺苯乙胺、尸胺、組胺和精胺未檢出，色胺、腐胺、酪胺和亞精胺均有檢出，但酪胺與亞精胺相對含量較低。未添加可同化氮果酒中生物胺總含量最高，添加DAP或/和FAN使可同化氮濃度增加可有效減少生物胺的形成，二次添加可同化氮果酒生物胺總含量顯著高于相同濃度單次添加可同化氮的藍莓果酒[F1DA：（125.602 8±0.285 0）mg/mL、F1AD：（130.818 5±6.432 1）mg/mL、F3D：（27.844 2±0.586 9）mg/mL、F3A：（92.690 2 ±0.935 0）mg/mL；F2DA（101.5040±2.3550）mg/mL、F2AD（130.866 8±3.145 9）mg/mL、F4D：（94.084 8±1.694 0）mg/mL、F4A：（67.1349±0.2586）mg/mL]。

進一步研究個別生物胺的含量變化，結果如圖3。

較添加FAN而言，添加DAP可更顯著降低色胺、亞精胺含量（圖3A、3D）；添加低濃度DAP果酒中腐胺含量低于添加低濃度YAN果酒，添加濃度超過400 mgN/L后，添加DAP果酒中腐胺含量急劇增加，添加YAN果酒則急劇下降（圖3B）；添加YAN可顯著降低酪胺含量，添加DAP濃度超過400 mgN/L時，酪胺含量大幅升高，可達（5.6032±0.1813）mg/mL（圖 3C）。

葡萄酒可檢出超過20種生物胺，主要含組胺、腐胺、酪胺[14]。本研究藍莓果酒中檢出色胺、腐胺、酪胺和亞精胺，以色胺和腐胺為主，果酒種生物胺含量及種類少于葡萄酒。比較藍莓果實與葡萄果實可知，葡萄汁含有至少18種游離氨基酸[1]，而園藍藍莓汁只含有11種游離氨基酸，缺少賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）等氨基酸（表二），而生物胺含量與食品中存在的游離氨基酸關系密切[14-15]，故藍莓果酒生物胺種類與葡萄酒存在差異可能與游離氨基酸差別有關。同時，研究認為蘋果酸-乳酸發酵發酵過程中產生了大量的生物胺，乳酸菌種類決定了添加可同化氮果酒中生物胺含量的增加或減少[14，16]，進一步分離研究藍莓果酒蘋果酸-乳酸發酵過程中乳酸菌生理生化及發酵特性或許有助于揭示藍莓果酒生物胺變化規律的內在機制。

圖3 可同化氮濃度對藍莓果酒各生物胺含量的影響Fig.3 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of different kinds of biogenic amine in blueberry wine

3 結論

本研究以藍莓果實為原材料，通過初始單添加不同濃度DAP或FAN以及二次混合添加DAP和FAN進行果酒發酵試驗，首次探索了添加不同濃度、不同種類可同化氮對藍莓果酒中生物胺及氨基甲酸乙酯含量的影響。研究結果顯示，隨初始發酵液中可同化氮濃度增加，果酒中氨基甲酸乙酯含量升高，添加DAP果酒氨基甲酸乙酯含量顯著高于添加FAN果酒；二次添加果酒未檢測到氨基甲酸乙酯；隨初始發酵液中可同化氮濃度增加，果酒中生物胺含量減少，添加DAP果酒生物胺含量低于添加FAN果酒，單添加果酒生物胺含量低于二次添加果酒。本研究認為藍莓果酒發酵添加可同化氮有助于降低生物胺含量，同時可同化氮添加濃度低于800 mgN/L時，果酒中氨基甲酸乙酯含量均符合國家安全限量標準。研究結果為進一步揭示可同化氮對藍莓果酒安全性影響及制定藍莓果酒可同化氮添加標準提供了依據。