靜電場軌道阱高分辨質譜篩查辣椒粉中7種酸性色素

張慧敏，鞠玲燕，徐成鋼，王靜，李兆杰，劉玉敏，崔鳳杰，崔嘉

（威海出入境檢驗檢疫局，山東威海264205）

我國GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]中明確規(guī)定食品中允許添加的色素種類，如天然色素和部分水溶性的合成色素。工業(yè)色素是能使其他物質獲得鮮明而堅實顏色的有機物，通常顯色亮麗，不易褪色，所以一般用來對油漆、鞋油、汽油、汽車、玩具等用品增光[2-3]，在食品中嚴禁使用，例如橙色Ⅱ屬于一級致癌物，酸性間胺黃成人誤服0.25 g就可中毒，其違法性質和量刑巨大[4-5]。工業(yè)色素按照官能團可以分為以下幾類：中性色素、酸性色素、堿性色素等[6]。為防止一些不法分子節(jié)約成本，在食品中添加工業(yè)色素，給人民身心健康帶來嚴重危害，有必要建立高靈敏、準確、快速的篩查檢測方法。

食品中工業(yè)色素的檢測方法多采用液相色譜法[5-9]和液質聯用法[10-13]，前處理方法和檢測的工業(yè)色素種類不盡相同，對于中性色素和堿性色素的報道較多，酸性色素的研究較少，而且多集中于液相色譜檢測方法[6-7]。目前尚未見采用高分辨質譜測定辣椒粉中酸性色素的報道，靜電場軌道阱高分辨質譜是在FullMS/ddMS2模式下同時進行一級質譜全掃描和數據依賴的二級質譜掃描，其以母離子作為定量離子，簡化了質譜參數的優(yōu)化，節(jié)省了樣品分析前的準備工作，更利于樣品的快速篩查和定量分析。并且靜電場軌道阱高分辨質譜具備基于數據庫的多種未知物的篩查功能，較普通串聯質譜分辨率更高，適用于對食品中多種有害物進行快速篩查的發(fā)展方向[14-15]。

本研究選擇7種較為常見的酸性色素作為研究對象，以辣椒粉為基質，建立超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法對7種酸性色素進行快速篩查和定量。方法采用Q-Exactive的正負離子切換模式獲得一級數據，通過提取目標化合物的一級質譜精確質量數獲得定性和定量結果，通過自動觸發(fā)獲得的二級全掃描數據進一步提高定性的準確性。該方法快捷、方便、高通量，可用于辣椒粉中7種酸性色素的快速篩查和確證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀（Q-Exactive）：美國 ThermoFisher公司；高速離心機（CR22GⅡ）：日立公司；超聲波提取儀（SB5200）：必能信超聲（上海）有限公司。

混合標準溶液為酸性紫紅B（acid carmoisine B）、酸性黑Ⅰ（acid clack 1）、橙色Ⅰ（orange 1）、橙色Ⅱ（orange 2）、酸性深藍 P-2RB（acid blue 113）、酸性間胺黃（metanil yellow）、羅丹明 110（rhodanmine 110）：德國Dr.Ehrenstorfer公司，稱取上述標準品適量，用甲醇∶水（1∶1，體積比）配成質量濃度為1 000 mg/L的儲備液，于4℃下避光保存，使用時逐級稀釋。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國默克公司；乙酸銨（分析純）：萊陽經濟技術開發(fā)區(qū)精細化工廠；辣椒粉：當地超市。

1.2 色譜質譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，15%A；2 min～2.1 min，15%A～40%A；2.1 min～8.1 min，40%A～80%A；8.1 min～9 min，80%A；9 min～10 min，15%A。分析時間：10 min。

1.2.2 質譜條件

噴霧電壓：正離子模式3.5 kV，負離子模式2.8 kV；離子源溫度：300℃；傳輸金屬毛細管溫度：350℃；鞘氣壓力：35 kPa；輔助氣壓力：15 kPa；掃描范圍（m/z）：150 Da～750 Da；一級質譜全掃描（Full scan）分辨率：R=70 000；自動增益控制進入軌道阱中的離子數：3e6；最大注入時間：100 ms；數據依賴二級離子全掃描分辨率：R=17 500；歸一化碰撞能設為40 eV，在此基礎上加減 50%；2e5；最大注入時間：50 ms；動態(tài)排除：10 s。

1.3 樣品前處理

準確稱取1.00 g樣品于20 mL離心管中，準確加入10 mL甲醇∶水（1∶1，體積比），渦旋，超聲輔助提取10 min，8 000 r/min 離心 5 min，取上清液過 0.45 μm 濾膜，上機檢測。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

研究考察了甲醇、水、甲醇∶水（1∶1，體積比）3種溶劑的提取效果，如圖1所示。

發(fā)現甲醇、水、甲醇∶水（1∶1，體積比）對大部分酸性色素的提取效率大致相當，但是甲醇∶水（1∶1，體積比）混合液對羅丹明110提取效率明顯優(yōu)于水，因此，選擇甲醇∶水（1∶1，體積比）混合液作為提取液。

2.2 流動相的優(yōu)化

在流動相的選擇中，發(fā)現橙色Ⅰ和橙色Ⅱ的分子式相同，均為C16H11N2O4SNa，但是結構不同，而且在提取精確質量數327.044 50時出現兩個色譜峰，互為同分異構體。本研究通過優(yōu)化流動相，對比乙腈-水、甲醇-水、10 mmol/L乙酸銨-甲醇、10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相對待測物色譜分離的影響，如圖2所示。

10 mmol/L乙酸銨-乙腈做流動相時各化合物的信號相應較高，而且可以實現橙色Ⅰ和橙色Ⅱ基線分離，通過比較這兩種化合物的保留時間可以將二者有效區(qū)分。

圖1 不同提取試劑對7種酸性色素提取效率的影響Fig.1 Effect of different reagents on extraction efficiencies of 7 acid dyes

2.3 色譜柱的優(yōu)化

考察 ACQUITY UPLC@BEN C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 超高效色譜柱、ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）超高效色譜柱和普通的C18色譜柱對待測物的分析效果。結果表明，在相同流動相的前提下，ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）能夠提供更好的分離效果。本試驗選擇ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）作為色譜柱。

2.4 質譜條件的優(yōu)化

本研究采用高分辨質譜的一級質譜全掃描加數據依賴的二級質譜掃描方式，通過全掃描確定7種酸性色素的保留時間，對目標檢測物進行定性篩查和確證。使用高分辨質譜檢測目標化合物的精確質量數對于同時準確定性和定量非常重要，因此必須保證質譜數據具有良好的質量準確度，如表1所示。

7種酸性色素的質量準確度誤差均小于2 μg/kg，可見檢測物的質量準確度均很好，可以滿足定性需求。

高分辨質譜最大的優(yōu)勢是通過高分辨率消除樣品中的基質干擾，提高定性和定量結果的準確性。研究發(fā)現，當一級全掃描采用分辨率R=70 000，所有待測物可與基質中干擾物實現基線分離。根據獲得的精確質量數設定目標物列表，僅在一級質譜掃描時發(fā)現列表中的母離子，且其強度達到設定閥值時，可自動采集二級質譜掃描。碰撞能量設為40 eV，并在此基礎上加減50%，即有3個碰撞能量對目標物進行碰撞，最終加和獲得豐富的碎片離子。歐盟EC 2002/657號文件對多級質譜確證時的碎片類型和識別點有明確規(guī)定，禁用物質確證須有4個識別點，在高分辨質譜中，母離子的識別點為2.0，子離子的識別點為2.5，因此只需一個母離子和一個子離子即可對目標物確證[16]。通過7種酸性色素的二級質譜全掃描獲得碎片離子信息，提高定性的準確性，如圖3和表1所示。

表1 7種酸性色素的精確質量數、保留時間、相對質量偏差及碎片離子信息Table1 Accurate masses，retention time，relative mass deviations and fragment ions of 7 acid dyes

圖3 7種酸性色素的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of 7 acid dyes

2.5 線性關系和檢出限

本研究以母離子作為定量離子，采用外標法定量。用不含待測物的空白基質溶液配置一系列標準樣品，經高分辨質譜測定，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，對照溶液的質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，用基質空白溶液逐級稀釋標準溶液至儀器所能檢出的最低濃度確定為檢出限（limit of detection，LOD），如表2所示。

表2 7種酸性色素的線性回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限Table2 Linear regression equations，correlation coefficients，linear ranges and LODs of 7 acid dyes

7種酸性色素在相應濃度范圍內呈良好的線性關系，可滿足檢測要求。

2.6 回收率及精密度

選取辣椒粉為空白樣品，分別添加3個不同濃度水平的混合標準溶液，按2.3方法進行前處理，每個水平重復測定6次，計算其回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果表明，7種酸性色素測定的平均回收率為78.6%～105.3%，RSD為3.5%～6.3%。該方法具有較好的回收率和重復性，可以滿足辣椒粉中7種酸性色素日常檢測要求。

2.7 實際樣品的檢測

用本方法對10份辣椒粉樣品進行測定，結果未發(fā)現酸性色素的陽性樣品。

3 結論

本研究利用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜，建立快速定性篩查和定量分析辣椒粉中7種酸性色素的方法。方法采用高分辨率質譜進行分析，高分辨質譜的高分辨率可以有效清除辣椒粉的基質干擾效應，同時利用數據依賴的二級質譜全掃描獲得豐富的碎片離子，可以對定性結果進行確認，提高了篩查結果的準確性，大大降低了假陽性出現的幾率。該方法快速、準確，覆蓋多種酸性色素，可用于辣椒粉中酸性色素的快速檢測。