泰山灰樹花母種及液體菌種最佳培養(yǎng)條件的研究

劉姍姍，孟麗，趙姣姣，王麗穎，朱孟娟

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安271018）

泰山灰樹花（Grifola frondosa）是泰山特有的一種野生珍稀食藥用真菌，其肉質(zhì)脆嫩、香味濃郁，味道鮮美，口味極佳，深受當(dāng)?shù)厝藗兊南矏?ài)[1]。多分布于海拔700 m～1 100 m的范圍內(nèi)，在泰山的夏、秋季節(jié)，常生長(zhǎng)于栗樹等闊葉樹的周圍[2]。

從分類上來(lái)說(shuō)，泰山灰樹花屬于層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、灰樹花屬（Ramalina），它的子實(shí)體呈珊瑚狀分枝，末端扇形或匙形，重疊成簇[3-4]。灰樹花不僅富含高質(zhì)量的氨基酸、膳食纖維、微量元素、維生素、有機(jī)酸等[5]，還含有很多活性物質(zhì)如多糖[6-8]、糖蛋白[9-10]、蛋白質(zhì)或肽類[11-12]等，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂、降膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、抑制糖尿病、提高免疫力等功效，是一種極具開發(fā)價(jià)值的功能性食藥用真菌[13-18]。

有關(guān)泰山灰樹花的研究主要集中在生物學(xué)特性、人工栽培、海藻糖及多糖的提取3個(gè)方面。蘇延友等研究了泰山灰樹花的生物學(xué)特性及人工培育技術(shù)[2]。有研究報(bào)道，泰山灰樹花子實(shí)體的最適生長(zhǎng)溫度為22℃左右，環(huán)境相對(duì)濕度為90%，生長(zhǎng)階段要求有較強(qiáng)的散射光，可覆土栽培[19]。李艷玲等對(duì)泰山灰樹花液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化并從中提取了海藻糖[20]。李曉倩則通過(guò)微波輔助的方法從泰山灰樹花菌絲體中提取了多糖物質(zhì)[21]。在以上的研究中，研究者對(duì)泰山灰樹花母種培養(yǎng)條件的研究大多不系統(tǒng)，而且缺少泰山灰樹花液體菌種培養(yǎng)方面的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究將對(duì)泰山灰樹花母種和液體菌種的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，以補(bǔ)充和填補(bǔ)相關(guān)數(shù)據(jù)，為泰山灰樹花的人工栽培提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

泰山灰樹花4號(hào)：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物基地保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g，酵母膏2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，水 1 L，pH 自然。

1.1.3 試劑與設(shè)備

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、瓊脂：購(gòu)于山東省泰安市普天公司。

SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；G180T立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋：致微儀器有限公司；H2P-250全溫培養(yǎng)振蕩器：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DGT-G250電熱鼓風(fēng)干燥箱：合肥華德科學(xué)器材有限公司；RXZ-380A-LED智能人工氣候箱：寧波江南儀器廠；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 泰山灰樹花母種培養(yǎng)基最適碳源的篩選

采用單因素試驗(yàn)法，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉5種糖作為碳源，依次代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，制備相應(yīng)的培養(yǎng)基，共制備5種不同碳源的培養(yǎng)基。121℃滅菌30 min后，倒入直徑為90 mm的無(wú)菌平板中，冷卻待用。利用打孔器將準(zhǔn)備好的泰山灰樹花平板菌種打成直徑7 mm的圓形菌片，定量接種于上述做好的平板培養(yǎng)基中央，每個(gè)平板接種一個(gè)菌片，每種培養(yǎng)基接種3個(gè)平板。接種完成后，置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3天后每天定時(shí)測(cè)量并記錄菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度（十字交叉法測(cè)量）、長(zhǎng)勢(shì)及邊緣的整齊度，并計(jì)算菌絲的日均增長(zhǎng)量。

Affected individuals carry the risk for colorectal,endometrial and ovary, genitourinary tract, stomach, hepatobiliary, pancreas and small bowel cancers (Figure 3).

1.2.2 泰山灰樹花母種培養(yǎng)基最適氮源的篩選

分別以蛋白胨、酵母膏、尿素、NH4NO3作為氮源，依次代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，參照1.2.1中的方法制作平板培養(yǎng)基并接種，每種培養(yǎng)基接種3個(gè)平板，然后置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3天后每天定時(shí)測(cè)量并記錄菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度（十字交叉法測(cè)量）、長(zhǎng)勢(shì)及邊緣的整齊度，并計(jì)算菌絲的日均增長(zhǎng)量。

1.2.3 測(cè)定不同添加物對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響

參照1.2.1和1.2.2的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，添加物100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。添加物分別為栗樹木屑和栗樹樹葉。具體操作為：先將添加物放入水中煮沸10 min，過(guò)濾取濾液，然后再加入葡萄糖、酵母膏等其它成分，制作成培養(yǎng)基。121℃滅菌30 min后，倒入直徑為90 mm的平板中，冷卻待用。利用打孔器將準(zhǔn)備好的泰山灰樹花平板菌種打成圓形菌片，定量接種于上述做好的平板培養(yǎng)基中央，每個(gè)平板接種一個(gè)菌片，每種添加物培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù)。接種完成后，置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3天后每天定時(shí)測(cè)量并記錄菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度（十字交叉法測(cè)量）、長(zhǎng)勢(shì)及邊緣的整齊度，并計(jì)算菌絲的日均增長(zhǎng)量。

1.2.4 測(cè)定泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的最適溫度

參照1.2.1、1.2.2和1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，確定本試驗(yàn)的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，栗樹木屑100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH值自然。按照培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基并滅菌待用。按照1.2.1的方法定量接種后，分別置于22、24、26、28、30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)重復(fù)。3天后每天定時(shí)測(cè)量并記錄菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度（十字交叉法測(cè)量）、長(zhǎng)勢(shì)及邊緣的整齊度，并計(jì)算菌絲的日均增長(zhǎng)量。

參照1.2.1、1.2.2和1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，確定本試驗(yàn)的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，栗樹木屑100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，水 1 L，pH 值自然。按照培養(yǎng)基配方制作液體培養(yǎng)基，倒入250 mL的三角瓶中，每瓶150 mL，然后用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 值，使其分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每種pH值設(shè)置3個(gè)重復(fù)，121℃滅菌30 min后，冷卻待用。分別用打孔器取泰山灰樹花平板菌種6片接種于三角瓶?jī)?nèi)，然后置于溫度為24℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。10天后測(cè)定培養(yǎng)液中菌絲體的干重。

1.2.5 泰山灰樹花液體菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以轉(zhuǎn)速、接種量和溫度為3個(gè)因素，以菌絲體干重為參考指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)參照表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

本試驗(yàn)的液體培養(yǎng)基配方同試驗(yàn)1.2.4。按照培養(yǎng)基配方制作培養(yǎng)基后，倒入250 mL的三角瓶中，每瓶150 mL，共制作27瓶。然后參照表1中的參數(shù)，將事先準(zhǔn)備好的泰山灰樹花液體菌種搖勻后用移液管定量接種到三角瓶中，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種完成后，參照表1的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。10天后測(cè)定每瓶發(fā)酵液中菌絲體的干重。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析與處理

所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 泰山灰樹花母種培養(yǎng)基最適碳源的篩選

利用單因素試驗(yàn)法，分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉5種糖作為碳源，測(cè)定其對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 不同碳源對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響Table2 The effect of different carbon sources on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表2中可以看出，以葡萄糖作為碳源，培養(yǎng)得到的菌落直徑最大（73.10 mm），且菌落邊緣整齊，菌絲顏色潔白。以果糖作為碳源培養(yǎng)的的菌落直徑和以麥芽糖為碳源培養(yǎng)的菌落直徑雖然相差不大，但果糖作為碳源培養(yǎng)的的菌落邊緣比麥芽糖為碳源培養(yǎng)的菌落邊緣整齊。以蔗糖和淀粉作為碳源培養(yǎng)的菌落直徑最小。綜上分析可知，泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)最適碳源為葡萄糖。

2.2 泰山灰樹花母種培養(yǎng)基最適氮源的篩選

分別以酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸銨作為氮源，測(cè)定其對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 不同氮源對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響Table3 The effect of different nitrogen sources on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表3中可以看出，培養(yǎng)10天后，以酵母膏作為氮源培養(yǎng)的菌落直徑最大，為58.25 mm，而且菌絲潔白，菌落邊緣整齊。在蛋白胨和硝酸銨作為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲長(zhǎng)速相差不大，但在以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌落邊緣不規(guī)則。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲不能生長(zhǎng)。綜上分析，泰山灰樹花最最適的氮源為酵母膏。

2.3 測(cè)定不同添加物對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響

通過(guò)測(cè)定不同添加物對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響，得到結(jié)果如表4所示。

表4 不同添加物對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響Table4 The effect of different additives on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表4中可以看出，與對(duì)照組相比，添加栗樹木屑和栗樹樹葉都能夠在一定程度上促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，但添加栗樹木屑后，菌絲生長(zhǎng)的速度最快，到第10天時(shí)菌落直徑達(dá)到78.83 mm，而且菌絲潔白，菌落邊緣整齊。

2.4 測(cè)定泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的最適溫度

分別測(cè)定不同溫度對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如表5所示。

表5 不同溫度對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響Table5 The effect of different temperature on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表5中可以看出，在20℃～30℃的范圍內(nèi)，菌絲均能生長(zhǎng)。但溫度在24℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)10天后，菌落的直徑最大，菌絲生長(zhǎng)速度最快，且菌落邊緣整齊，所以培養(yǎng)泰山灰樹花菌絲的最適溫度為24℃。

2.5 測(cè)定泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的最適pH值

通過(guò)測(cè)定不同pH值下泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)10天后的菌絲體干重，得到表6。

表6 不同酸堿度對(duì)泰山灰樹花菌絲生長(zhǎng)的影響Table6 The effect of different pH on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表6中可以看出，在pH值為6時(shí)，菌絲體的干重最多，且菌絲球數(shù)量最多，密實(shí)。在pH值為5時(shí)，菌絲體干重稍小一些，但菌絲球也很多，說(shuō)明在pH值5～6的范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)狀況最好，最適合的pH值為6。pH值低于5或高于6時(shí)，菌絲生長(zhǎng)狀況不佳。

2.6 泰山灰樹花液體菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以轉(zhuǎn)速、接種量和溫度為3個(gè)因素，以菌絲體干重為參考指標(biāo)，對(duì)泰山灰樹花液體菌種培養(yǎng)條件進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。

分析表7中的R值可知，這3個(gè)因素對(duì)泰山灰樹花液體菌種的影響程度依次為B＞A＞C，即接種量＞轉(zhuǎn)速＞溫度。分析表中的K值，可以看出各因素水平優(yōu)選的最佳方案為A1B3C2，對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)編號(hào)7，而從菌絲體干重來(lái)看，也是7號(hào)試驗(yàn)的菌絲體干重最重，為7.32 g/L。因此通過(guò)正交試驗(yàn)得出，泰山灰樹花液體菌種在轉(zhuǎn)速120 r/min，接種量20 mL，溫度為24℃的條件下培養(yǎng)，效果最佳，培養(yǎng)10天后的菌絲體干重為7.32 g/L。

表7 泰山灰樹花液體菌種培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table7 The results of cultivation conditions for Taishan Grifola frondosa liquid spawn by orthogonal test

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要針對(duì)泰山灰樹花母種和液體菌種的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了泰山灰樹花母種的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏，適合的添加物為栗樹木屑，培養(yǎng)的最適酸堿度為pH 6.0，培養(yǎng)的最適溫度為24℃。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)速、接種量和溫度三因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定了泰山灰樹花液體菌種的最佳培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速120 r/min，接種量20 mL，溫度24℃。在此條件下培養(yǎng)出的泰山灰樹花液體菌種表現(xiàn)出分散性好、菌絲生長(zhǎng)旺盛、菌齡一致等特點(diǎn)。以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)于泰山灰樹花的人工栽培和推廣具有重要的參考價(jià)值。