眼柄切除對口蝦蛄卵巢、肝胰臟和肌肉生化組分的影響

姜麗楠，閆紅偉，羅明正，崔 鑫，沈旭芳，王連順，劉海映，劉 奇

( 1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學 海洋科技與環境學院， 遼寧 大連 116000； 3.大連海洋大學，遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116000 )

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)是我國沿海重要的經濟種類，其肉嫩味美，營養豐富，在許多國家和地區都是重要的漁業資源[1-3]。在我國，由于捕撈過度及環境惡化等因素影響，口蝦蛄資源嚴重衰退[4-5]，市場價格日益攀升。為保護現有資源并滿足日益增長的消費需求，口蝦蛄人工增殖、養殖迫在眉睫[6]。而充分了解其特殊的繁殖生物學特征，是實現人工增養殖的重要基礎。

目前，在口蝦蛄性腺發育與人工繁育方面，國內外均開展了一系列研究工作。如口蝦蛄精巢與卵巢發育分期規律已基本摸清[7-9]；分布在我國和日本的口蝦蛄主要種群繁殖生物學規律也有詳細報道[10-12]；在繁殖功能相關基因的克隆與表達也有初步研究[13]。20世紀80—90年代，Hamano 等[14-17]對口蝦蛄產卵、孵化、幼體發育、生長及營底棲生活洞穴等情況進行了詳細研究，為人工育苗和最終養成奠定了重要基礎。王波等[18]首次對口蝦蛄人工育苗開展探究，孫丕喜等[19]以在水泥池底放置泥沙的方法來培育口蝦蛄親體并獲成功。王春琳等[20-21]利用土池進行親蝦促熟和抱卵孵化，苗種供應問題初步得到解決。此外，劉海映[22]在我國北方也基于土池育苗方法，采用生物餌料，優化現有育苗工藝，多次成功促熟雌性口蝦蛄，所產苗種質量和數量進一步得到提高。以上研究極大地豐富了口蝦蛄繁殖生物學的研究內涵，但在人工調控繁殖方面，依然鮮見研究。

眼柄中的X器官—竇腺復合體是甲殼動物的重要內分泌器官，分泌性腺抑制激素和高血糖激素等神經肽類物質參與調節性腺成熟。Panouse[23]首次發現切除鋸齒長臂蝦(Palaemonserratus)眼柄能促進卵巢發育成熟。隨后研究人員對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[24]、克氏原螯蝦(Proucambarusclarkii)[25]、中華絨鰲蟹(Eriocheirsinensis)[26]、遠海梭子蟹(Portunuspelagicus)[27]及日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[28]等也進行了相關研究，并再次證實眼柄切除確實可不同程度地促進甲殼動物卵巢快速發育成熟，顯著提高甲殼動物人工養殖效率。研究亦表明，雙側眼柄切除對蝦蟹類的攝食行為、游泳行為等諸多方面的影響要比單側眼柄切除劇烈，且動物因機械損傷承受的痛苦更明顯，故單側眼柄切除比雙側眼柄切除具有更高的存活率，人工養殖效果也更好[29]。截至目前，有關眼柄切除對甲殼動物生長、繁殖的影響研究主要集中于十足目種類上，而對口足目研究較少。口蝦蛄作為口足目中的優勢種群，切除眼柄能否促進卵巢發育，以及對卵巢、肝胰臟和肌肉中生化組成的影響尚未見報道。

筆者在口蝦蛄卵巢發育期切除其單側眼柄，分析性腺指數、肝胰腺指數以及機體重要部位生化組分的變化，以了解眼柄在口蝦蛄生長，發育和繁殖過程中的內分泌功能，為相關研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年4月初在口蝦蛄卵巢發育期，自遼寧省大連市皮口海域采集體表光滑、附肢完整、活力強、卵巢發育周期相近并開始發育的雌性口蝦蛄160尾，經低溫處理后運至實驗室，于循環海水水族箱內暫養。采集的口蝦蛄樣本體長為10.20～15.20 cm，體質量為18.24～39.98 g。經短暫升溫后，水溫控制在23 ℃，每日數次投喂沙蠶、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等新鮮餌料直至飽食。每日補充20%新鮮海水，飽和充氣。

1.2 方法

1.2.1 單側眼柄切除

暫養14 d后，隨機挑選10尾雌性口蝦蛄，解剖并分別取出卵巢、肝胰臟和肌肉組織，記錄卵巢和肝胰臟質量，分別放入樣本袋中于-80 ℃冰箱保存待用。然后再隨機選取雌蝦80尾，采用鑷燙法切除右側眼柄，作為試驗組。同時去除暫養過程中的死亡個體和活力不強個體，剩余60尾雌蝦蛄作對照組。養殖條件與暫養條件一致。試驗開始后分別在第5、10、15、20 d和25 d，每次采集試驗組與對照組口蝦蛄各10尾，樣品處理方法與上述相同，所有個體均解剖出卵巢、肝胰臟和肌肉組織，分別放入樣本袋中于冰箱-80 ℃保存待用。

1.2.2 性腺指數和肝胰腺指數

利用下列公式計算雌性口蝦蛄性腺指數和肝胰腺指數，其中體質量、卵巢質量和肝胰臟質量均為濕質量狀態下所測數據。

性腺指數/%=m1/m×100%

肝胰腺指數/%=m2/m×100%

式中，m為體質量，m1為卵巢質量,m2為肝胰臟質量。

1.2.3 糖原與蛋白含量測定

將第0、5、10、15、20 d和25 d采集到雌性口蝦蛄卵巢、肝胰臟和肌肉組織按取樣時間分別混勻，制成混樣。一方面，設置3組平行，各個組織分別稱量出0.2 g，與質量分數為0.9%生理鹽水，按體積比1∶9混合勻漿，7500 r/min離心10 min后取上清液，使用蛋白質測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定不同組織的總蛋白含量；另一方面，按取樣時間將各個組織的混樣冷凍干燥后，也設置3組平行，分別稱量0.05 g，采用蒽酮比色法測定糖原含量。

1.2.4 數據處理

試驗數據用平均值±標準誤表示。使用獨立樣本T檢驗檢驗同一取樣時間試驗組與對照組間的差異。*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；使用單因素方差依次分析整個試驗階段性腺指數和肝胰腺指數及生化組成的變化。當方差齊時，使用Turkey命令進行組間多重比較；當方差不齊時，使用Tamhane′s T2 (M) 進行近似檢驗，以不同字母表示具有統計學意義的差異 (P<0.05)。

2 結 果

2.1 切除眼柄的雌性口蝦蛄的性腺指數

試驗組口蝦蛄性腺指數在切除眼柄后逐漸上升，在第15 d達到峰值(12.1%)后下降；而對照組口蝦蛄性腺指數在整個試驗期間也存在相應趨勢。此外，在第5、10、15 d時，試驗組口蝦蛄性腺指數顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

2.2 切除眼柄的雌性口蝦蛄的肝胰腺指數

試驗期間，對照組與試驗組口蝦蛄肝胰腺指數分別為2.5%～3.3%和2.6%～3.4%，變化趨勢基本一致。在各取樣點，試驗組與對照組差異不顯著(P>0.05)，但試驗前期(第0、5、10 d)的肝胰腺指數顯著高于后期(第15、20 d)(P<0.05)(圖2)。

2.3 切除眼柄后雌性口蝦蛄各組織糖原的含量

切除眼柄前，雌性口蝦蛄卵巢中糖原含量為1.0%。切除眼柄后，卵巢中的糖原含量逐漸上升，在眼柄切除后第15 d達到峰值(3.0%)后下降，在第20 d降至1.7%，試驗組內存在顯著差異(P<0.05)(圖3)。對照組卵巢中的糖原含量也呈現先升后降的趨勢，在第10 d達到峰值(2.4%)后回落；組內各取樣點間也存在顯著差異(P<0.05)。試驗組糖原含量高于對照組，在第5、15 d兩者分別具有顯著(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肝胰臟中糖原含量為1.0%，之后，試驗組糖原含量逐漸上升，在第10 d上升至最大值(5.2%)后下降，且試驗組內各取樣點間存在顯著差異(P<0.05)(圖3)；對照組肝胰臟中的糖原含量變化趨勢與試驗組類似。然而，各采樣點試驗組的糖原含量均明顯高于對照組，差異極顯著(P<0.01)。

圖1 切除眼柄后雌性口蝦蛄的性腺指數不同大寫和小寫字母分別代表試驗組和對照組組內取樣點間差異顯著(P<0.05).*，代表試驗組和對照組差異顯著(P<0.05)，**，代表試驗組和對照組差異極顯著(P<0.01).其他圖同.

圖2 切除眼柄后雌性口蝦蛄的肝胰腺指數

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肌肉中糖原含量也為1.0%，而后試驗組肌肉中的糖原含量逐漸上升，并在第5 d達到最高值(2.4%)，隨后不斷下降，第25 d達最低值(0.6%)，組內各取樣點間存在顯著差異(P<0.05)。對照組肌肉中的糖原含量變化趨勢與試驗組類似，起初逐漸升高，在第10 d達到最高值(2.4%)后逐漸下降，同樣至第25 d達最低值(0.2%)，組內各取樣點間差異顯著(P<0.05)。試驗組糖原含量在第25 d顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 切除眼柄后雌性口蝦蛄各組織蛋白的含量

切除眼柄前，雌性口蝦蛄卵巢中的蛋白含量為113.4 mg/g，切除眼柄后，卵巢中的蛋白含量在第0～10 d無明顯變化，在第15 d達到峰值(142.4 mg/g)，隨后下降。在整個試驗階段，對照組口蝦蛄卵巢中的蛋白含量波動不大，在第20 d達到峰值(125.7 mg/g)。眼柄被切除后，卵巢中的蛋白含量高于對照組，在第15 d存在極顯著差異(P<0.01)。

圖3 切除眼柄后雌性口蝦蛄不同組織的糖原的含量

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肝胰臟中蛋白含量為31.5 mg/g，切除眼柄后，蛋白質含量顯著上升，于第25 d上升至最高值(55.3 mg/g)。對照組肝胰臟中的蛋白質含量變化規律與試驗組不同，蛋白含量在0～5 d逐漸上升，而在5～10 d迅速下降，并到最低值(20.7 mg/g)，隨后蛋白含量再次上升。試驗組肝胰臟中的蛋白含量在第10 d顯著高于對照組(P<0.05)。試驗組和對照組中，組內各取樣點間的蛋白含量差異顯著(P<0.05)。

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肌肉中蛋白含量為47.0 mg/g，切除眼柄后，肌肉中的蛋白含量略微上升，并在第10 d達到最高值(64.3 mg/g)，隨后下降，第25 d達最低值(44.2%);組內各取樣點間，蛋白含量差異并不顯著。對照組在第10 d達到最高值(88.9 mg/g)，顯著高于試驗組(P<0.05)；隨后也開始下降，至第25 d也達最低值(44.1 mg/g)；對照組各取樣點間的蛋白含量存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 切除眼柄后雌性口蝦蛄不同組織的蛋白含量

3 討 論

位于眼柄的X器官—竇腺復合體能夠分泌多種神經肽類激素，包括性腺抑制激素、蛻皮抑制激素、高血糖激素等[30-31]。其中分泌的性腺抑制激素最先見于雌性蝦蟹類，因此又稱卵黃發生抑制激素[32]。后來發現雄性體內也分泌該激素[33]。DeKleijin等[34]對美洲龍蝦(Homarusamericanus)生殖周期中X-器官性腺抑制激素的mRNA表達及血淋巴組織中的積累含量研究發現，性腺抑制激素只在卵黃發生前期和未成熟期的血淋巴組織中高表達。故推測，性腺抑制激素可能抑制卵黃發生。Warrier等[35]比較歐洲龍蝦(H.gammaeus)幼體和成體卵黃發生抑制激素發現，幼體含量遠高于成體，認為卵黃發生抑制激素在幼體期高表達有利于機體發育，在成體期低表達有利于卵巢發育，在性腺發育期起抑制作用。性腺抑制激素靶器官為卵巢和肝胰臟，它能抑制卵黃發生和成熟，進而抑制甲殼動物的卵巢發育，故切除眼柄可加速蝦蟹類卵巢成熟。Panouse[23]首次提出在鋸齒長臂蝦卵巢發育期，切除眼柄阻礙性腺抑制激素分泌，可促進卵巢體積增大、卵黃沉積。在其他甲殼類的研究中得到類似結果[36]。

3.1 切除眼柄后對雌性口蝦蛄卵巢的影響

口蝦蛄一年性成熟，生物學最小型約為8 cm[14]。Ohtomi等[10]認為日本東京灣口蝦蛄繁殖季節在4—8月，性成熟高峰期有2個，分別為4—5月和7—8月。第1個高峰由體長超過10 cm的成熟雌體形成；第2個高峰則由體長超過8 cm的成熟雌體形成。薛梅等[9]認為，皮口海域雌性口蝦蛄性成熟高峰期也有2個，推測產卵盛期在 5—9 月和 11—12 月。此外，孫丕喜等[19]發現體長大于10 cm 的雌性口蝦蛄可以進行人工繁育。本試驗中所采集的口蝦蛄樣本體長為10.20～15.20 cm，故適宜人工促熟研究。

本試驗中，切除單側眼柄后，口蝦蛄性腺指數呈上升趨勢，切除后5～15 d顯著高于對照組，意味著與其他蝦蟹類一樣，口蝦蛄眼柄中可能也存在抑制卵巢發育的性腺抑制激素[37]。上述性腺指數結果與凡納濱對蝦眼柄切除后的報道[38]一致。同時，本試驗還發現，眼柄切除后第20 d，對照組與試驗組性腺指數差異不顯著(P>0.05)。前期預試驗表明，雙側切除口蝦蛄眼柄致死率高，因此試驗中采用單側眼柄切除方法，但單側切除并未能完全抑制性腺抑制激素的分泌，這可能是導致試驗組性腺指數在20 d時出現下降的主要原因。此外，也有文獻報道，雌性口蝦蛄在繁殖期，對所處環境因子，如底質、洞穴結構和光等要求嚴格，若人工養殖的某種環境條件不同于自然環境，很可能對卵巢發育有一定的抑制作用，可能造成試驗組口蝦蛄性腺指數下降[39]。另一方面，對日本囊對蝦等甲殼類研究發現，肝胰臟的營養物質可以通過血液傳輸到卵巢用以儲存和代謝[40-41]。試驗結果表明，試驗組、對照組肝胰腺指數在試驗后期均出現顯著下降(P<0.05)，推測口蝦蛄卵巢在發育過程中，肝胰臟中的營養物質被消耗或者轉移至卵巢所致。

3.2 切除眼柄后對雌性口蝦蛄生化組分的影響

葡萄糖是甲殼類血淋巴中的主要單糖，能參與合成黏多糖、幾丁質、核糖等，或以糖原形式貯存作能源[42]。血淋巴中葡萄糖水平的穩定對神經、肌肉以及生殖系統功能至關重要[43]。肝臟是脊椎動物的主要貯能器官，當機體需要能量時，迅速從肝臟調取能量以供機體使用[44]。而包括甲殼類在內的無脊椎動物，一般沒有單獨的貯能器官[45]。試驗發現，試驗組和對照組的口蝦蛄，在卵巢、肝胰臟和肌肉中糖原含量均呈現先升后降的趨勢。同時，試驗組口蝦蛄卵巢和肝胰臟中的糖原含量高于對照組，肌肉中的糖原含量從5 d開始下降，明顯早于對照組。這些結果說明，無論眼柄是否被切除，在卵巢發育過程中，3種組織中的糖原均作為最直接的供能物質，為卵巢發育提供能量；切除眼柄組的口蝦蛄能量轉移與代謝程度更高。

蛋白質是生命體維持生命活動的物質基礎，為卵巢發育提供營養物質等，在甲殼類動物卵巢發育中具有重要作用[46]。一般來說，卵黃蛋白原是雌性卵生成熟甲殼動物中的特異蛋白；也是幾乎所有卵生動物卵黃蛋白的前體；主要作為一種分子載體運輸營養物質到卵細胞，為胚胎發生和早期幼體發育提供蛋白質以及微量元素等[47]。劉海映等[48]研究發現，口蝦蛄卵黃蛋白原mRNA在肝胰臟和卵巢中均有表達，表明兩種組織均為卵黃蛋白合成部位。在其他甲殼類中，如凡納濱對蝦和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)，均發現肝胰臟和卵巢是其卵黃蛋白原的主要合成部位[49-50]。Quackenbush等[51]發現，切除凡納濱對蝦單側眼柄7～14 d，卵巢和肝胰臟中卵黃蛋白原合成速度加快。Pateraki等[52]研究亦發現，在切除雌性陸蟹(Potamonpotamios)眼柄后，卵黃蛋白合成加速。本研究發現，切除眼柄后，口蝦蛄肝胰臟中蛋白質含量不斷上升，表明切除單側眼柄，可能促進肝胰臟中蛋白質，尤其是卵黃蛋白的合成，有助于卵巢發育。而在卵巢和肌肉中蛋白質含量的往復變化特征可能與物質遷移與代謝有關。上述結果與凡納濱對蝦眼柄切除結果[38]存在差異，這可能是兩者取樣時間不同造成的；但與中華絨螯蟹研究結果[26]類似。

本試驗研究了切除眼柄后雌性口蝦蛄的性腺指數和肝胰腺指數的變化特征，以及卵巢、肝胰臟和肌肉中生化組成成分與對照組間的對應關系，試驗結果有助于加強口足目甲殼動物性成熟促進機理的認知，為豐富口蝦蛄繁殖內分泌學研究提供基礎資料。