超低溫冷凍保存中華鱘F1精子授精方法研究

舒德斌，劉雪清，張建明，肖 衎，趙 珣，郭柏福，姜 華，杜合軍

( 1.中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100；2.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443100 )

中華鱘(Acipensersinensis)隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，是典型的溯河生殖洄游性魚類，主要分布于我國東海、黃海和渤海大陸架水域及流入其中的大型河流中[1]，是我國特有的大型古老魚類，屬國家一級重點保護動物。葛洲壩水利樞紐的修建阻隔了中華鱘生殖洄游通道，其他人類活動和環境因素對其影響日益加重，中華鱘自然繁殖群體資源已極度瀕危[2-3]。中華鱘自然繁殖種群的性腺發育質量也有明顯下降的趨勢，雌雄性比失調及種群結構的變化和產卵場環境的改變將對中華鱘種群自然繁殖產生重要影響[4-5]。

精液超低溫冷凍保存技術在眾多的物種保護領域中具有重要的科研和應用價值，不僅可以用于種質資源的保存，也可以解決雌雄個體發育時空上的不一致[6]。國內外有學者對魚類精子超低溫冷凍保存技術進行了研究，并取得了一定進展[6-8]。中華鱘精液超低溫冷凍保存技術的研究與應用對解決中華鱘人工增殖過程中遇到的雄魚數量不足、雌雄親魚性腺發育不同步及其遺傳多樣性和種質資源的保存問題具有十分重要的意義。目前，柳凌等[9-10]先后開展了中華鱘精子超低溫冷凍保存和凍精授精試驗，獲得2.22%～6.98%的受精率；郭柏福等[11]在成功實現中華鱘全人工繁殖成功后，進行了中華鱘凍精授精試驗，獲得5%的受精率和0.5%的孵化率。這些研究雖然取得了初步成效，但超低溫凍存的精子受精率和孵化率均較低。凍精授精技術為魚類精子冷凍保存技術中關鍵一環。為此，筆者于2011—2013年間連續開展了研究工作，研究了授精方式、凍精用量及激活液對凍精授精效果的影響，旨在提高中華鱘凍精受精率和孵化率，優化中華鱘全人工繁殖技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

用于試驗的中華鱘精、卵均取自2010—2013年中華鱘研究所三峽基地和黃柏河基地蓄養成熟的中華鱘F1雄、雌親魚。雄魚經人工催產采集無污染的精液，按60～80 mL/袋分裝于雙層塑料保鮮袋中充氧，置于2～4 ℃的培養箱中短期保存，用作對照組，部分精液于-196 ℃的液氮中超低溫冷凍保存，用作凍精授精試驗。雌魚經催產采卵后立即進行授精試驗。

1.2 精子冷凍、解凍及質量評價

取活力大于80%的鮮精按兩步降溫法進行冷凍后浸入液氮中保存[9]。38～40 ℃水浴解凍，精液溶解后立即在顯微鏡下檢查精子活力。具體方法為：用一次性注射器針頭蘸取精液與載玻片上30 μL的井水混合，用針頭攪散，立即在100倍顯微鏡下觀察精子的運動情況。活力檢測由同一個人完成，每樣重復3次。精子活力為視野內快速活動精子占精子總數的百分比。用伊紅染色法對精子活力評估進行補充校驗[13]。

1.3 不同激活液授精效果比較

1.3.1 激活液的配制

用于比較的4種激活液配方見表1。

表1 4種不同的激活液

注: B液參考文獻[14].

1.3.2 操作方法

用2010年冷凍保存的(冷凍保存360 d)活力為(37.64±3.8)%的中華鱘F1精液，按精卵體積比1∶10，分別用A液、B液、C液、D液和水激活，進行干法授精。每組設3個平行。

1.4 不同授精方法比較

試驗中用3 mL中華鱘F1凍精與10 mL中華鱘F1卵子，分別采用干法和濕法授精。在確認雌魚排卵后，開始解凍復蘇精子，進行凍精授精試驗。每組設3個平行組，1個對照組。2012年和2013年先后進行了3次授精方法比較試驗。其中試驗1和試驗2使用的是2012年冷凍保存的中華鱘F1精液；試驗3使用的是2010年冷凍保存的中華鱘F1精液，試驗用卵子質量稍差。授精操作方法在文獻[15]方法的基礎上稍加調整。

濕法授精：直徑10 cm一次性平底塑料碗，將卵子和凍精各放到碗底一側(不混合)，再加水緩慢攪拌均勻，1 min后用清水沖洗除去多余精子，置于25%的滑石粉溶液中氣動脫黏，60 min后轉入孵化器孵化。

干法授精：直徑10 cm一次性平底塑料碗，放入卵子后加入凍精攪拌均勻，再加水緩慢攪拌1 min后，用清水沖洗除去多余精子，置于25%的滑石粉溶液中氣動脫黏，60 min后轉入孵化器孵化。

1.5 冷凍精液用量比較

用2012年冷凍保存的中華鱘F1精液，其冷凍保存365 d，密度為3.82×109個/mL，稀釋比1∶2，活力為(35.45±5.26)%，按0.1、0.3、0.6、1.5、3 mL用量分別與10 mL中華鱘F1卵子進行濕法授精。

1.6 數據的統計與分析

根據《中華鱘人工繁殖技術規程》[16]，魚卵發育至原腸晚期時統計受精率，魚卵發育至出膜前期時統計孵化率。相關數據采用Excel和SPSS 19.0統計軟件進行數據的計算分析。

2 結 果

2.1 激活液對凍精受精率的影響

冷凍保存360 d的凍精活力為(37.64±3.8)%，按精卵體積比1∶10，分別用A液、B液、C液、D液和水激活干法授精，結果顯示，用水激活授精的受精率和孵化率均顯著高于其他激活液(P<0.05)，分別獲得(15.04±0.58)%的受精率和(14.6±0.59)%的孵化率(圖1)。

圖1 不同激活液受精率和孵化率比較字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)，下同.

2.2 授精方式對受精率的影響

試驗1、試驗2和試驗3的濕法受精率和孵化率分別為(18.3±1.45)%、(13.57±0.76)%、(18.65±0.42)%和(16.82±2.01)%、(11.03±0.98)%、(15.87±1.25)%；干法受精率和孵化率分別為(9.49±1.21)%、(6.96±2.01)%、(8.31±0.19)%和(7.66±0.53)%、(4.11±1.58)%、(6.26±0.24)%。結果顯示，濕法授精效果均優于干法授精，且具有顯著性差異(P<0.05)(表2)。

表2 授精方式對受精率的影響 %

注:表中同列不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05).

2.3 凍精用量對受精率的影響

凍精用量對受精率和孵化率有一定影響。隨著凍精用量的增加，受精率和孵化率先升后降(圖2)，0.6 mL時受精率和孵化率較高，分別為(16.43±1.57)%和(14.58±1.35)%。此后，隨著凍精用量的增加，受精率和孵化率呈下降趨勢，與0.6 mL組相比差異顯著(P<0.05)。

圖2 凍精用量對受精率的影響

3 討 論

3.1 激活液對受精率的影響

通常認為，冷凍精子解凍后其活力及受精能力將會顯著降低，采用低滲溶液激活精子，其運動效果好于用淡水激活[17-19]。Tris-HCl為鱘魚精子激活液的常用成分，其主要用作pH緩沖成份[20-23]，適宜含量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+和葡萄糖可以提高中華鱘精子活力[24-26]。本試驗結果顯示，同樣條件下，用水激活授精的受精率和孵化率均顯著高于其他激活液。可顯著增加中華鱘凍精被激活后運動速度的激活液B液[14]，在本試驗中并未獲得較高的受精率和孵化率。分析認為，可能提高精子活力的條件，不一定適合卵子受精的條件，即激活液對卵子受精的環境條件產生了不利的影響。甘芳等[27]研究顯示，適量的陽離子和葡萄糖作為中華鱘鮮精激活授精介質時可提高中華鱘卵受精率。筆者推測這種差異除了超低溫冷凍給中華鱘精子帶來冷凍損傷的因素外[10]，是否還與試驗中的4種激活液均含有Tris-HCl及凍精的抗凍稀釋液成分有關，有待進一步研究。

3.2 干法和濕法授精對受精率的影響

本試驗中干法授精和濕法授精最大的不同是在授精過程中，干法授精是將卵子和凍精先進行充分混合，然后進行激活授精；而濕法授精是將凍精和卵子用水激活同時混合授精。試驗結果顯示，同樣條件下，濕法授精效果優于干法授精。這可能是因為干法授精時，精卵充分混合過程中，凍精含有的抗凍稀釋液影響其與卵子混合接觸，即干法授精混合接觸的時間和相對含量比濕法授精時的要長要高，不利中華鱘卵子的受精。

3.3 凍精用量對受精率的影響

凍精的用量是影響受精率的重要因素之一。有研究表明，在活力一定的情況下，隨著用量的增加受精率呈直線上升趨勢，有的可接近鮮精受精率水平。如肖志忠等[28]研究發現，大黃魚(Pseudosiaenacrocea)凍精授精時的精卵比高于0.8×106∶1，受精率均接近鮮精受精率；當精卵比低到一定比值時，受精率會降至35%。陳松林等[19]研究發現，草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)凍精授精的精卵比一定范圍內，受精率隨著密度的增加呈直線上升；當精卵比超過1.6×106∶1時，受精率接近鮮精水平，再增加時受精率基本不變。西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)授精的最佳精卵比也取得了近似的結果[26]。本試驗結果表明，凍精用量為0.1～0.6 mL，隨著用量的增加，受精率呈上升趨勢，超過0.6 mL，受精率則隨之下降。分析認為，在最佳精卵比的基礎上，除了魚類精子的生理特性不同外，在加大凍精用量的同時，也加大了抗凍稀釋液對卵子受精不利的影響。

根據凍精生理特性尋找有效的激活授精方法是提高凍精受精率的關鍵之一[6]。本試驗重點研究了授精方式、凍精用量及激活液對凍精授精效果的影響。在中華鱘凍精授精過程中，采用水激活、濕法授精及適宜授精的精卵比例這3種方法的有效組合，在保證足夠的凍精活力前提下，盡可能減少中華鱘凍精抗凍稀釋液和精子激活液對精子、卵子受精能力的不利影響，可以提高中華鱘凍精授精的受精率。