企鵝珍珠貝抗氧化系統對銅暴露的響應

嚴俊賢，李有寧，于 剛，吳開暢，馬振華，陳明強

( 1.中國水產科學研究院 南海水產研究所，熱帶水產研究開發中心，海南 三亞 572018； 2.中國水產科學研究院 南海水產研究所，農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東 廣州 510300 )

近年來，近海海域受到人類活動的影響越來越大，海洋受到重金屬的污染也日益嚴重。重金屬能夠在生物體內積蓄，沿食物鏈富集，威脅海洋生物生產以及人類食品安全[1-2]。銅(Cu)是海洋環境中最常見的重金屬污染物之一，金屬冶煉、機械制造、有機化工等均排放大量的含銅廢水。銅離子經陸地水系遷移至海洋造成部分近海海域的銅含量偏高，危害海洋生物的生存[3]。銅是生物體所需的微量元素，參與多種酶的形成與反應，但過量的銅與生物重要分子非特異性結合產生毒性，嚴重者導致DNA分子斷裂[4-6]，對生物幼體的危害尤大[7-8]。用于生產附殼珍珠的企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)是我國海水珍珠養殖業的主要經濟種類之一，在海南、廣東以及廣西海域大量養殖[9]。海洋雙殼貝類體表可吸收、吸附和攝食積累海洋中的重金屬，其抗氧化系統對重金屬的污染反應靈敏，是監測海域重金屬污染的重要物種[10-11]。目前，已利用紫貽貝(Mytilusedulis)體內的生物標志物對重金屬敏感的特點監測海區的重金屬污染程度，早期預警環境污染[12-14]。生物體內的抗氧化酶活性，如谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等是重金屬污染的生物標志之一，能夠反映重金屬污染物對機體的傷害程度，診斷環境中的重金屬污染。目前，縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、貽貝、文蛤(Meretrximeretrxi)、牡蠣等海洋雙殼類對重金屬污染的抗氧化酶活性已有較多的研究報道[15-20]，但有關銅污染對企鵝珍珠貝的抗氧化系統的影響卻罕見報道。筆者將企鵝珍珠貝暴露于一定銅含量條件下，探索肝胰腺組織中谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性的變化規律，進一步了解企鵝珍珠貝在重金屬影響下的生理機制，為拓展海洋環境監測手段提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用分析純五水硫酸銅購自國藥集團化學試劑有限公司。試驗用海水取自海南省陵水縣新村港海域，經48 h暗沉淀、砂濾以及紫外消毒處理，鹽度為33.1。試驗用1齡企鵝珍珠貝，殼長(86.72±8.59) mm，殼高(82.01±5.46) mm，殼寬(30.25±2.47) mm，體質量(88.24±13.32) g，采自陵水縣黎安港，在0.7 m3水泥池中暫養15 d。期間投喂球等邊金藻(Isochrysisgalbana)，平均水溫為(27.6±1.0) ℃。試驗前1 d停止投餌，選擇反應靈敏、閉合力強、體質量及規格相近的企鵝珍珠貝作為試驗對象。用南京建成生物研究所生產的試劑盒測定谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的抗氧化酶活性。

1.2 方法

試驗在容積為0.2 m3玻璃鋼水桶中進行。試驗期間，每日更換Cu2+溶液1次，24 h持續充氣，貝密度為0.1個/L。根據已有的研究結果[15,21]，設計3個Cu2+質量濃度組和對照組，質量濃度分別為10、20、40 μg/L，每個處理3個平行。暴露時間為96 h，試驗期間不投餌，分別于0、6、12、24、48、72、96 h隨機取樣，測定谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性(U/mg)。取試驗貝肝胰腺0.5 g，剔除結締組織，用消毒生理鹽水沖洗，置于離心管內液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存，用于測定抗氧化酶活性。

1.3 數據處理

試驗數據用平均數±標準差表示，利用統計軟件SPSS 19.0對活性系數進行單因素方差分析，得到組間的差異顯著性；利用作圖軟件SigmaPlot 12.0作圖。

2 結 果

2.1 不同銅質量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶的活性

對照組企鵝珍珠貝的谷胱甘肽過氧化物酶活性變化很小(P>0.05)，說明在未添加Cu2+的海水中，谷胱甘肽過氧化物酶活力相對穩定，其他3組企鵝珍珠貝肝胰臟中抗氧化酶的活性則隨時間的推延而增長。Cu2+質量濃度為10 μg/L時，96 h內谷胱甘肽過氧化物酶活性持續上升，72 h活性最高，兩者間差異不顯著(P>0.05)；12～24 h谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著提高(P<0.05)，而24 h之后酶活力變化平穩。20 μg/L時，0～6 h谷胱甘肽過氧化物酶活力激增(P<0.05)，72～96 h則明顯下降(P<0.05)，12 h活性最高，12～72 h則保持較高的活力水平。隨暴露時間的延長，40 μg/L試驗組谷胱甘肽過氧化物酶活性平穩升高，72 h達到峰值，隨后則平穩下降，該組的峰值不及前2組的峰值高(圖1)。

2.2 不同銅質量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中過氧化氫酶的活性

96 h內對照組企鵝珍珠貝肝胰臟中過氧化氫酶的活性較穩定。10 μg/L Cu2+質量濃度組肝胰臟中過氧化氫酶活性在24 h內增幅不大(P>0.05)，48 h則活力明顯升高，隨后又明顯下降(P<0.05)。20 μg/L Cu2+質量濃度組的過氧化氫酶活性則隨時間推移持續上升，72 h達最大值，96 h則保持相對平穩的水平(P>0.05)。暴露于40 μg/L Cu2+質量濃度組的過氧化氫酶活力則出現“上升—下降”的變化規律，暴露6 h 酶活性顯著升高(P<0.01)，直至48 h仍然保持較高活力，72 h明顯下降(P<0.05)。10 μg/L Cu2+質量濃度組過氧化氫酶活性的峰值均顯著低于20 μg/L 和40 μg/L Cu2+質量濃度組的最高值(圖2)。

圖1 不同Cu2+質量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶的活性

圖2 不同Cu2+質量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中過氧化氫酶的活性

2.2 不同銅質量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性

試驗期間對照組企鵝珍珠貝肝胰臟中的超氧化物歧化酶活性一直較低，而10 μg/L Cu2+質量濃度組超氧化物歧化酶活性則隨時間的延長而上升趨勢，72 h達到最大值，96 h活性顯著下降(P<0.01)。Cu2+質量濃度為20 μg/L時，超氧化物歧化酶活性呈“上升—下降”的變化趨勢，峰值出現在24 h，隨后平穩下降。Cu2+質量濃度為40 μg/L組企鵝珍珠貝肝胰臟中的超氧化物歧化酶活性在96 h內平穩增長，96 h酶活性最大，而24 h便進入相對穩定的較高酶活性水平(圖3)。

圖3 不同Cu2+質量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性

3 討 論

3.1 重金屬銅對企鵝珍珠貝肝胰臟抗氧化酶活性的影響

環境中的重金屬進入無脊椎動物體內，會誘導產生大量的活性氧產物，包括過氧化氫、游離態氧等。這些活性氧產物的積累使機體中多不飽和脂肪酸被過氧化或造成DNA氧化損傷等，體內的抗氧化系統便會激活，清除活性氧、抵御氧化損傷[22-23]。超氧化物歧化酶可將OH和O2-轉化為O2和H2O2；過氧化氫酶將有害物質H2O2分解成O2和H2O；谷胱甘肽過氧化物酶則作為底物可分解多種過氧化物[24-26]。這些抗氧化酶構成了主要保護酶系統，防御機體氧化損傷。企鵝珍珠貝暴露在20 μg/L質量濃度Cu2+時，谷胱甘肽過氧化物酶活性在短時間內快速上升，而40 μg/L質量濃度組則上升緩慢，說明高質量濃度銅對肝胰腺中細胞起到一定的損傷，限制了谷胱甘肽過氧化物酶活性的提升。在40 μg/L質量濃度下，過氧化氫酶活性在短時間內便快速上升，顯著高于其他劑量組，說明高質量濃度Cu2+溶液對過氧化氫酶活性的誘導較靈敏。在Cu2+污染時12 h內超氧化物歧化酶活性被逐漸誘導，隨著活性氧產物的誘導增加，在12 h后達到較高活性，而40 μg/L質量濃度組中，直至96 h，肝胰腺中超氧化物歧化酶活性仍然保持較高的活性，說明較高質量濃度Cu2+可持續誘導超氧化物歧化酶的活性。其他貝類如菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)在銅污染下抗氧化酶先誘導后抑制，大量活性氧產物未能及時清除，機體受到損失并使酶活力受到抑制[27]。而本研究中，重金屬銅對企鵝珍珠貝肝胰臟中的抗氧化酶均無明顯的抑制作用，說明抗氧化酶對活性氧產物的清除能力較強，企鵝珍珠貝肝胰臟組織對銅污染具有一定的耐受能力。

3.2 抗氧化酶對重金屬銅的靈敏度

銅是多種清池消毒劑、殺蟲農藥等的主要成分，農業環境中殘留量較大，對生態環境的污染日益嚴重。挖掘生物體內的監測指標可有效發現生存環境的污染程度，抗氧化酶則是一類靈敏度較高的分子生態毒理學指示物。有研究表明，不同含量Cu2+污染時，長牡蠣(Crassostreagigas)閉殼肌、鰓和消化腺中的抗氧化酶系統隨時間推移呈“上升—峰值—下降”的變化規律，而消化腺的敏感性則為最高，因此，長牡蠣消化腺中的抗氧化酶對環境中Cu2+有一定指示作用[28]。企鵝珍珠貝肝胰腺中的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性在Cu2+作用下出現一定的變化規律，不同質量濃度Cu2+污染對機體氧化損傷程度不同，因而抗氧化酶的靈敏度各不相同。受到污染時抗氧化酶活性可誘導或抑制，可作為生態污染監測的標志物[29-33]。本研究中，企鵝珍珠貝的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性與污染物有顯著的“時間—含量—活性”相關效應，可作為重金屬Cu2+污染的監測標志物，肝胰腺中抗氧化酶靈敏度依次為谷胱甘肽過氧化物酶>過氧化氫酶>超氧化物歧化酶。