馬氏珠母貝F8代4種殼色選育群體的EST-SSR遺傳多樣性分析

譚 杰，孫宗紅，陶雅晉，姚高友，劉付少梅，劉錦上，劉志剛

( 1.廣東海洋大學 水產學院，廣東省南海經濟無脊椎動物健康養殖工程技術研究中心， 廣東 湛江 524088； 2.湛江銀浪海洋生物技術有限公司，廣東 湛江 524000； 3.雷州市源源至水產種苗繁育有限公司，廣東 湛江 524200 )

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)又稱合浦珠母貝(P.fucata)，在中國主要分布在南海、廣東、廣西、海南及臺灣南部沿海海域[1-2]。該貝是培育海水珍珠的重要經濟貝類，其孕育的珍珠稱為“南珠”，在國際珍珠市場占據重要地位，具有極高的經濟價值[3]。

1965年中國首次成功突破馬氏珠母貝人工育苗技術，隨后南珠產業迅猛發展，至20世紀90年代，該產業已成為廣東、廣西和海南等地區經濟發展的重要支柱[4]。然而快速發展的同時，問題也日益突顯。長期的累代養殖、不科學的育苗方式、頻繁的病害侵擾和惡化的生存環境，使得馬氏珠母貝種質退化嚴重，具體表現為生長速度緩慢、存活率降低、珍珠質量和產量下降等[5-6]。目前許多養殖戶因為養殖經濟效益低而處于停產觀望狀態。改良舊品種，培育新品種，克服種質退化，促進國內馬氏珠母貝產業健康可持續發展已成為業界的共同呼聲。為此，科研工作者開展了馬氏珠母貝品種改良研究，并取得了一定成效。如杜曉東等[7]采用群體和家系選育的方法，獲得了馬氏珠母貝“海選1號”新品種，該品種與未經選育的馬氏珠母貝相比，2齡貝平均殼寬和平均殼長分別提高21.2%和20.8%，留核率與珍珠珠層厚度分別提高22.3%和22.2%；何毛賢等[8]經6代群體選育，培育出了殼型肥厚、優質珍珠率高的“南科1號”新品種；喻達輝等[9]通過家系基因聚合為核心的選擇育種技術，選育出了生長快、育珠性能優良的“南珍1號”新品種。

馬氏珠母貝的殼色具有多態性，且不同殼色個體在生長速度、育珠性能、存活率等方面存在差異[10]。本課題組以殼色為輔助標記，以生長快、存活率高為選育目標，采用群體繼代選育的方法開展了馬氏珠母貝紅、黑、黃、白4種殼色新品種培育研究。迄今為止，該貝4種殼色群體已經歷8代選育且取得了較理想的選育效果，殼色趨于純化、各經濟性狀均優于普通群體。但在分子層面上，經過8代群體繼代選育后的4種殼色群體遺傳分化程度如何，遺傳差異達到什么水平，尚未查明。EST-SSR標記來源于基因的編碼區，具有多態性高、數量豐富及共顯性遺傳等特點，能較準確地反映物種的遺傳多樣性[11-15]。筆者采用10對EST-SSR 引物對馬氏珠母貝4種殼色群體的遺傳多樣性進行研究，以期從分子層面上揭示該貝4種殼色選育系F8的遺傳差異和分化水平，為選育工作提供分子科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

課題組在廣東省湛江市雷州源源至公司經8年群體繼代選育獲得馬氏珠母貝紅、黑、白、黃4種殼色群體，每種殼色群體隨機挑選40個健康、有活力的個體，清洗干凈后活體運回廣東南海經濟無脊椎動物健康養殖工程技術研究中心實驗室，暫養3 d后，取閉殼肌組織置于無水乙醇中-20 ℃保存，用于后續DNA提取。

1.2 DNA提取及引物篩選

取無水乙醇保存的閉殼肌組織，解凍、剪碎，采用上海生工生物公司Ezup柱式提取試劑盒提取DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，用分光光度計測定DNA的質量濃度。檢測合格后用無菌水稀釋至同一質量濃度，分裝-20 ℃保存備用。選取10對擴增效果好的EST-SSR引物用于4種殼色馬氏珠母貝群體遺傳多樣性分析，引物參考文獻[16]，序列信息及退火溫度見表1。EST-SSR引物由上海生工生物公司技術部合成。

表1 EST-SSR引物序列及退火溫度

1.3 PCR擴增及產物檢測

10 μL反應體系：TaKaRa Taq TM酶(5 U/μL)0.1 μL，10×buffer 1.0 μL，MgCl2(2 mmol/L)0.6 μL， dNTPs(25 mmol/L)0.8 μL，正向引物和反向引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.9 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；30次循環(94 ℃變性30 s，50～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR擴增產物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若有清晰擴增條帶則使用DYY-6C型電泳儀進行8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒定電壓150 V，電泳3.5 h)，擴增產物分離后，固定、銀染、顯色、觀察、拍照。

1.4 數據統計與分析

使用Gel-Pro analyzer軟件對聚丙烯酰胺凝膠圖上的等位基因條帶進行定位，確定等位基因的大小和基因型；利用Popgene32軟件計算群體的等位基因數、有效等位基因數、期望雜合度、觀測雜合度、遺傳相似系數以及遺傳距離等，同時進行Hardy-Weinberg平衡檢驗[17]。使用PIC-CALC軟件計算多態信息含量；用MEGA 4.1構建UPGMA樹[18]。

2 結 果

2.1 EST-SSR位點的多態性

10個EST-SSR位點的多態性參數見表2。10個位點共檢測到46個等位基因，各位點的等位基因數為2～7個，平均等位基因數為4.6個，其中位點PmartE27的等位基因數最少(2個)，位點PmartE32和PmartE43的等位基因數最多(7個)；有效等位基因數為1.0880～5.1939個，平均有效等位基因數為3.1132個；期望雜合度為0.0812～0.8108，平均期望雜合度為0.6040；觀測雜合度為0.0833～0.9917，平均觀測雜合度為0.5595；多態信息含量以位點PmartE32為最高，達到0.7482，位點PmartE29最低，為0.0796，平均多態信息含量為0.5517，說明10個位點的遺傳多樣性豐富，其中有7個高度多態位點(多態信息含量>0.5)，2個中度多態位點(0.25<多態信息含量<0.5)和1個低度多態位點(多態信息含量<0.25)。

表2 10個EST-SSR位點的遺傳多態性參數

2.2 4種殼色馬氏珠母貝群體的遺傳多樣性

4種殼色馬氏珠母貝群體的平均等位基因數為3.5～4.0，平均有效等位基因數為2.288～2.730；平均觀測雜合度為0.445～0.627，平均期望雜合度為0.479～0.580，除黃殼色群體外，其余3種殼色群體的觀測雜合度均大于期望雜合度，說明不存在雜合子缺失的情況；Shannon多樣性指數為0.850～1.042；平均多態信息含量為0.423～0.509，每種殼色群體多態信息含量低于0.5的位點為3～6個，低于0.25的位點為1～2個，這與選擇作用有關，4種殼色群體的多態性信息含量處于中低等水平。黃殼色群體中位點PmartE33以及白殼色群體中位點PmartE29的平均觀測雜合度、平均期望雜合度和多態信息含量值均為0，說明這兩個位點在這兩個群體中雜合子缺失嚴重，基本達到純合。黃殼色群體中各遺傳參數值最小，而紅殼色群體中除有效等位基因數外，其他參數值等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度、多態信息含量和Shannon多樣性指數均最大，說明紅殼色群體的遺傳多樣性最高，黃殼色群體的遺傳多樣性最低，4種殼色群體總的遺傳多樣性維持在較高水平。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗

Hardy-Weinberg平衡檢驗結果表明，40個群體—位點組合中有31個組合顯著偏離平衡(P<0.05)，占總位點的77.5%。4種殼色群體中均偏離的位點有5個(PmartE10、PmartE23、PmartE26、PmartE35、PmartE38)，在白、黑、黃3種殼色群體中顯著偏離的位點有1個(PmartE32)。紅殼色群體中有6個位點(60%)顯著偏離平衡，白殼色群體中有8個位點(80%)顯著偏離平衡，黑殼色群體有8個位點(80%)顯著偏離平衡，黃殼色群體中有9個位點(90%)顯著偏離平衡。說明人工選擇壓力下，群體基因頻率發生了改變。

表3 4種殼色馬氏珠母貝群體在10個EST-SSR位點的遺傳多樣性參數

注：Na：等位基因數；Ne：有效等位基因數；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；I：Shannon多樣性指數；PIC：多態信息含量；P：哈溫平衡檢驗；*：顯著偏離哈溫平衡(P<0.05).

2.4 4種殼色馬氏珠母貝群體的遺傳分化

10個EST-SSR位點在4種殼色群體中的遺傳分化指數為0.0101～0.3025，平均為0.1206(0.05<遺傳分化指數<0.15)(表4)，說明4種殼色群體間的遺傳分化處于中等水平，這與課題組8年群體繼代選育有關。各位點的基因流值0.5764～24.5841，除位點PmartE38的基因流值較大外，其位點的基因流值均較小，平均為1.8225，說明4種殼色馬氏珠母貝群體間未發生基因流動。

表4 4種殼色群體的遺傳分化指數和基因流值

2.5 4種殼色馬氏珠母貝群體間的遺傳距離和遺傳相似性

4種殼色馬氏珠母貝群體間的遺傳相似系數為0.7107～0.8418，遺傳距離為0.1742～0.3415，說明4種殼色馬氏珠母貝群體間存在一定的遺傳差異，其中紅殼色群體和黑殼色群體的遺傳相似度最高(0.8418)，遺傳距離最小(0.1722)，白殼色群體和黃殼色群體之間的遺傳相似度最低(0.7107)，遺傳距離最大(0.3415)。基于Nei′s遺傳距離，采用UPGMA法，對種殼色馬氏珠母貝群體進行聚類分析(圖1)，結果顯示4種殼色群體共分為3類，其中紅殼色群體和黑殼色群體最先聚為一類，然后和白殼色群體聚集成一類，最后與黃殼色群體聚為一類。

圖1 4種殼色馬氏珠母貝群體的聚類圖

群體紅殼色白殼色黑殼色黃殼色紅殼色—0.83170.84180.7458白殼色0.1842—0.79490.7107黑殼色0.17220.2296—0.8282黃殼色0.29330.34150.1885—

3 討 論

3.1 4種殼色馬氏珠母貝群體間的遺傳分化

遺傳分化指數和遺傳距離是衡量群體間遺傳分化程度的兩個重要指標，在良種選育過程中，由于人為施加的選擇壓力，基因頻率常常發生改變，群體間的遺傳分化水平也隨之改變。水產動物中，頡曉勇等[19]采用微衛星分子標記技術分析了吉富品系尼羅羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)9代選育群體的遺傳結構，得到F0與F6、F7、F8和F9代之間的遺傳分化指數分別為0.0377、0.0644、0.0609、0.0759，說明隨著選育代數的增加，吉富品系尼羅羅非魚的遺傳分化程度逐漸變大。陳靜等[10]以RAPD分子標記研究了馬氏珠母貝黑、白、紅、黃4種殼色選育系F3的遺傳變異，發現各殼色選育系間的遺傳分化系數為0.2143～0.3186，遺傳距離為0.1135～0.1968，大于王愛民等[20]利用RAPD分子標記分析的馬氏珠母貝3個不同地理野生群體間的遺傳距離，說明本課題組的馬氏珠母貝F3代殼色選育系的遺傳結構已發生改變，這與王學穎等[3]報道的馬氏珠母貝金黃殼色系F3和基礎群體間的遺傳分化系數一致。白成等[21]利用微衛星分子標記，分析了馬氏珠母貝F5代白、黑、黃、紅4種殼色家系的遺傳結構，結果顯示，4個家系間的遺傳分化系數值為0.113～0.793，與普通養殖群體及殼色選育系F5相比，4種殼色家系間的遺傳距離變大；朱曉聞等[1]報道馬氏珠母貝F5代4種殼色選育系群體在10個微衛星位點處的平均遺傳分化系數為0.0445，遺傳分化程度較小，遺傳距離為0.0629～0.1729；本研究中，紅、白、黑、黃4種殼色群體間的遺傳分化系數為0.0101～0.3025，平均值為0.1206，遺傳距離為0.1722～0.3415，與選育系F5代相比，F8代4種殼色群體間的遺傳距離和遺傳分化程度增大，遺傳變異提高，群體遺傳結構改變明顯，這是多年定向選育的結果。

3.2 人工選育對馬氏珠母貝4種殼色群體遺傳多樣性的影響

遺傳多樣性是良種選育的基礎和前提，因此，進行遺傳選育改良時要盡可能的維持選育群體的遺傳多樣性，預防經濟性狀衰退，以獲得高品質的新品種。本研究中，4種殼色馬氏珠母貝群體的平均等位基因數為4.5，其中紅、黑、白、黃4種殼色群體的等位基因數分別為4.0、3.7、3.6、3.5，其值均小于平均水平，說明每種殼色群體均存在等位基因丟失的現象且黃殼色群體丟失最嚴重，這與本課題組多年定向選育有關。因人工選育導致等位基因丟失的現象在鱖魚(Sinipercachuatsi)[22]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[23]、長牡蠣(Crassostreagigas)[24]、大珠母貝(Pinctadamaxima)[25]和仿刺參(Apostichopusjaponicus)[26]等水產動物群體中均有報道。有文獻資料顯示，馬氏珠母貝普通養殖群體的觀測雜合度為0.15～0.56，期望雜合度為0.38～0.75。朱曉聞等[1]報道殼色選育系F5代的期望雜合度為0.662～0.685，多態信息含量為0.6025～0.6230。本研究中，4個群體的觀測雜合度和期望雜合度分別為0.445～0.627和0.479～0.580，除黃殼色群體外，其余3種殼色群體的觀測雜合度均大于期望雜合度，說明這3個群體受人工選育的影響小，遺傳多樣性較豐富。與馬氏珠母貝普通養殖群體相比，4種殼色群體的觀測雜合度和期望雜合度處于中等水平，兩者之間存在一定的差異，出現差異一方面與人工施加的選擇壓力有關，另一方面與所選取位點的變異程度不同有關。與選育系F5相比，F8的期望雜合度和多態信息含量均降低，說明經過8代選育4種殼色馬氏珠母貝群體的遺傳多樣性降低，但總體仍處于較高水平。這與選育時選取的方法有關，本研究采用群體繼代選育的方式確保了有效繁育群體的數量，減少了近交衰退幾率。這與聶鴻濤等[27]報道的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)人工選育群體及田野等[28]報道的泥蚶(Tegillarcagranosa)人工選育群體遺傳多樣性變化的趨勢極相似。因此，在今后的選育工作中，應注重親本群體的數量，盡可能避免親緣近交，實現種質資源的健康可持續發展。