江鱈類志賀鄰單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗

張效平，楊 星，李小義，李正友，商寶娣

( 貴州省水產研究所，貴州 貴陽 550025 )

江鱈(Lotalota)屬鱈形目、鱈科、江鱈屬，是鱈科魚類中唯一的淡水種類，分布于北緯45°以北的歐亞和北美內陸水域，在我國僅分布于新疆額爾齊斯河及黑龍江水系上游，是我國冷水魚類珍稀物種，也是世界搶救性開發的品種之一[1-2]。江鱈具有較高的經濟價值、藥用價值和特殊的科學研究價值[3]。目前國內外研究主要集中在江鱈的生物學特性、人工繁育及馴養等方面[4-7]，尚未見江鱈細菌性疾病的報道。我國已攻克了江鱈人工繁殖技術，可大批量培育出夏花魚種。貴州省安順市某養殖場于2013年從新疆建設兵團引進江鱈魚種進行馴養。2014年7—8月，引進的江鱈出現以“魚體瘦弱，進食減少，體表發黑；離群獨游；下頜嚴重出血，腹部出血；鰭條腐爛；肝臟出血；腎臟有出血點；腸道內無食物；部分魚頭后背部有破損”為主要癥狀的疾病反應，持續時間為4周，約有50%的魚體發病并死亡。筆者從該養殖場取部分癥狀明顯的活體江鱈，實驗室條件下從發病江鱈體內分離得到菌株LLL-K-1，通過形態學觀察、生理生化特性檢測、16S rDNA基因序列分析等試驗結果鑒定該菌株為類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigellode)。菌株LLL-K-1回歸感染健康江鱈，可表現出與自然發病江鱈相同的癥狀，并從瀕死江鱈體內分離得到該菌，確定其為致病菌。并對致病菌的藥物敏感性進行了研究，旨在為其防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用魚

患病江鱈取自貴州省安順市某養殖場，體長(15.2±0.4) cm。

人工感染試驗所用江鱈購于安順市另一未發病養殖場，試驗用魚體色正常、體表無損傷、活力較好，平均體長(15±1.0) cm，暫養 7 d后用于試驗。

1.1.2 主要試劑及試劑盒

TSA培養基、TSB培養基、細菌微量生化鑒定管、MH培養基、藥敏試紙(購自杭州微生物試劑有限公司)；Primer Star HS DNA聚合酶、EasyTaq DNA聚合酶、dNTP 混合物、DNA Marker DL2000[大連寶生物工程(Takara)有限公司]；細菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技公司)；細菌16S rDNA通用引物(27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R：TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T，生工生物工程股份有限公司合成)。

1.1.3 主要儀器

生化培養箱(LRH-250F)、PCR基因擴增儀(BioRad)、核酸蛋白檢測儀(Eppendorf)、-80 ℃超低溫冰箱(海爾)、凝膠成像系統(Tanon)、全自動高壓滅菌鍋(HVE-50， HIRAYAMA)、常量天平(TE601-L， Sartorius)、超凈工作臺(蘇凈安泰BLB-1300)、正置顯微鏡(尼康 50i)等。

1.2 臨床診斷

現場觀察病魚的攝食情況、行為特點等。將病魚放入白色的搪瓷盤中，檢查病魚眼晴、鰭條、體表和鰓絲等部位的充血、潰爛、發炎、黏液情況，腹部腫大及肛門腫脹情況；解剖后觀察肝、腎、腸等器官病變反應。

1.3 實驗室診斷

隨機取6條癥狀明顯的病魚，塑料袋充氧迅速帶回實驗室做進一步檢查。

1.3.1 病原菌分離

75%的酒精擦拭病魚體表，無菌條件下解剖病魚，對肝、腎組織進行采樣，接種于TSA培養基，于28 ℃倒置培養24 h。平板上生長的菌落形態大小一致，隨機挑取單菌落，再次劃線TSA培養基，獲得純培養菌株共10株，來源于腎臟的8株編號為LLL-K-1～LLL-K-8，來源于肝臟的2株編號為LLL-L-1和LLL-L-2，10株分離菌呈一致的菌落特征，初步判定為1種菌，選擇LLL-K-1為代表株進行后續試驗。純培養物接種胰蛋白胨培養基，28 ℃培養24 h，菌種保存于15%甘油保種液中，置于-80 ℃備用。

1.3.2 病原菌形態學觀察

將細菌分離物接種于TSA培養基平板，28 ℃倒置培養過夜，肉眼觀察單菌落形態。將菌株培養12 h后進行革蘭氏染色觀察。

1.3.3 生理生化鑒定

參照《伯杰氏系統細菌學手冊》[8]中的細菌鑒定方法，采用細菌微量生化鑒定管對待測菌株進行各項生化指標的測定。

1.3.4 16S rDNA基因序列測定及系統發育分析

參照細菌DNA提取試劑盒說明書，提取病原菌DNA。以菌株基因組DNA為模板，細菌通用引物27F和1492R進行16S rDNA 序列的PCR擴增。PCR體系：5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL 10 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物各1 μL、1 μL DNA模板、1 μL 聚合酶、39 μL ddH2O。擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s、30 個循環；72 ℃ 10 min。

擴增產物參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行DNA回收純化，由生工生物工程(上海)有限公司測序。

測序結果在GenBank數據庫中進行Blast分析，從比對結果中選取相似度最高的菌株序列，使用Clustal X 1.83進行多重比對分析，然后通過Mega 4 軟件及鄰接法構建系統發育進化樹，所建發育樹各分支的置信度由Bootstrap進行1000次循環檢驗。

1.3.5 回歸感染試驗

將分離株接種于TSB培養基，28 ℃培養18 h，7200 r/min離心10 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，調節菌懸液密度為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105cfu/mL。取暫養7 d的健康江鱈，隨機分為6組，每組6尾。采用腹腔注射的方法，對5個試驗組分別注射5種密度的菌懸液，0.3 mL/尾，同時設對照組，注射等量滅菌磷酸鹽緩沖液。每個試驗組均設置一平行組。每日觀察、記錄各組的發病癥狀和死亡數量，對剛死亡的病魚進行細菌分離鑒定，試驗周期為10 d。通過SPSS 13.0 軟件計算半數致死密度。

1.3.6 病原菌藥物敏感試驗

根據紙片擴散法將藥敏紙片貼于涂布有密度為5×106cfu/mL分離菌的MH瓊脂平板上，28 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。所用的抗生素及含量為：氨芐青霉素(10 μg/片)、先鋒霉素Ⅴ(30 μg/片)、克拉霉素(15 μg/片)、依諾沙星(10 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那青霉素(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、哌拉西林(100 μg/片)、利福平(5 μg/片)、大觀霉素(100 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、復方新諾明[(23.75+1.25) μg/片]、四環素(10 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩諾沙星(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、多西環素(30 μg/片)、氟氧頭孢(30 μg/片)、多黏菌素B(30 IU/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、先鋒霉素Ⅵ(30 μg/片)、青霉素G(10 U/片)。

2 結 果

2.1 患病江鱈臨床表現及宏觀病理變化

病魚魚體瘦弱，體表發黑，攝食量減少；離群獨游；下頜嚴重出血，腹部出血；鰭條腐爛；肝臟出血；腎臟有出血點；腸道內無食物；部分魚頭后背部有破損。

2.2 病原菌形態特征

10株分離菌呈一致的菌落特征：在TSA瓊脂培養基上菌落圓形、邊緣整齊、中間凸起、白色不透明、表面濕潤、直徑為1～2 mm；在營養肉湯培養基中均勻渾濁生長，表面無菌膜形成。

革蘭氏染色鏡檢結果顯示，病原菌呈革蘭氏陰性。

2.3 分離菌生理生化特征

分離株主要生理生化特征為氧化酶陽性，發酵葡萄糖產酸不產氣，產賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸脫氫酶，不產脲酶，不產硫化氫，產吲哚，硝酸鹽還原陽性，能發酵肌醇、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖，明膠液化、V-P試驗、七葉苷發酵等指標陰性(表1)。結果顯示，菌株LLL-K-1與類志賀鄰單胞菌具有相似的表型特征。

2.4 16S rDNA基因序列測定及系統發育分析

PCR擴增獲得長度約1500 bp的基因片段。經純化測序，測定的菌株序列(登錄號：KP284552)在GenBank 中進行Blast同源性比對，結果顯示,菌株LLL-K-1所測序列與已上傳的類志賀鄰單胞菌16S rDNA核苷酸序列相似性達99%。選擇GenBank中同源性較高的細菌16S rDNA序列，并以柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)為外群，進行比對分析并構建系統發育樹(圖1)，發現菌株LLL-K-1與類志賀鄰單胞菌聚為一族。

綜合常規生理生化和16S rDNA 基因序列分析結果表明，菌株LLL-K-1為類志賀鄰單胞菌。

2.5 回歸感染試驗

用類志賀鄰單胞菌LLL-K-1進行腹腔注射感染健康江鱈，回歸感染試驗表明，江鱈在注射1.0×109cfu/mL 菌懸液6 d后開始出現死亡，隨著攻毒時間的延長各密度菌液對江鱈的累積死亡率結果見圖2。由表2可知，注射菌液密度為1.0×105cfu/mL 組在攻毒后10 d內未出現死亡，1.0×106cfu/mL 組的累積死亡率為16.67%，1.0×107cfu/mL組的累積死亡率為33.33%，而1.0×109cfu/mL組和1.0×108cfu/mL組在10 d內的累積死亡率分別為83.33%和58.33%；在整個試驗期間，空白對照組魚未見異常。經計算，類志賀鄰單胞菌LLL-K-1的半數致死密度為4.3×107cfu/mL。

經注射類志賀鄰單胞菌LLL-K-1患病魚出現病癥與自然發病癥狀一致，主要表現為體表發黑，下頜出血，腹部出血，鰭條腐爛，解剖可見肝臟出血、腎臟有出血點。從人工感染發病的魚體中重新分離到的菌株經生化鑒定和分子鑒定表明其與感染用的類志賀鄰單胞菌LLL-K-1一致，由此可以確定該菌株為患病鱈魚的病原菌。

2.6 藥敏試驗

K-B紙片擴散法進行藥物敏感性測試，在24種供試藥物中，類志賀鄰單胞菌LLL-K-1對氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、依諾沙星極度敏感，對先鋒霉素Ⅴ、多西環素、新霉素高度敏感，對氟苯尼考、復方新諾明、四環素、大觀霉素、氧氟頭孢鈉、多黏菌素B中度敏感，對哌拉西林、克拉霉素、妥布霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、卡那青霉素、利福平頭孢曲松、先鋒霉素Ⅵ、青霉素G耐藥(表3)。

表1 分離株的生理生化試驗結果

注：*，《伯杰氏系統細菌學手冊》[8]中對類志賀鄰單胞菌的描述；+，陽性反應；-，陰性反應；F，發酵反應；R，拮抗反應；D，菌株間有差異.

圖1 基于16S rDNA序列構建的系統進化樹

分組密度/cfu·mL-1注射劑量/mL試驗魚數量/尾死亡量/尾死亡率/%11×1090.3121083.3321×1080.312758.3331×1070.312433.3341×1060.312216.6751×1050.31200對照00.31200

表3 類志賀鄰單胞菌LLL-K-1的藥敏試驗結果

注：S，敏感(直徑≥15 mm)；I，中度敏感(10 mm<直徑<15 mm)；R，耐藥(直徑≤10 mm).

圖2 隨著攻毒時間的延長江鱈的累積死亡率

3 討 論

3.1 類志賀鄰單胞菌的分離鑒定

類志賀鄰單胞菌是鄰單胞菌屬的唯一菌種，曾一度劃歸到弧菌科，后根據其在分子水平上與鄰單胞菌和變形桿菌更為接近，于2005年《伯杰氏系統細菌學手冊》(第2版)確立為腸桿菌科。

3.2 藥物敏感試驗及防控

超級菌(多重耐藥菌)、藥物殘留、環境污染等問題已引起世界范圍的高度重視。對分離到的類志賀鄰單胞菌LLL-K-1進行藥物敏感性分析發現，該菌對氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、依諾沙星等幾種藥物敏感，對哌拉西林、克拉霉素、妥布霉素、慶大霉素等耐藥。這些結果與Salgado-Miranda 等[16,20]的試驗結果不同，可能是由于地域、環境和宿主不同引起的，也可能是由于分離株不同的藥物接觸史造成的，菌株間耐藥性的差異給細菌病的治療帶來極大困難。所以在實際工作中要做到以防為主，改善養殖環境、保持良好水質、投喂優質飼料是防病的關鍵。在養殖過程中一旦發現江鱈有減食、停食、活動異常等情況時，應及時送檢，根據藥敏試驗結果和漁用藥物使用準則科學地選用藥物，避免因誤診和延誤治療引起更大的經濟損失，又可避免因亂用、濫用和長期反復使用同一種藥物造成細菌產生耐藥性。