乳腺癌患者血液中PGRMC1濃度與臨床相關性

趙 越 阮祥燕，2* 張泉東 王虎生 李 雪 蔡桂舉 谷牧青 Alfred O. Mueck，2

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京 100026；2.德國圖賓根大學婦產醫院婦女健康部與婦女健康研究中心, 圖賓根 D-72076，德國；3. 解放軍263醫院外科，北京 101149)

在全球女性群體中，乳腺癌已經成為最常見的浸潤性癌癥之一，女性一生中罹患乳腺癌的概率為1/8。2015年中國腫瘤新發病例數為429.2萬，其中女性乳腺癌發病人數為26.86萬，占到女性新發腫瘤的15%，其中45～59歲的發病率為23%[1]。這個年齡階段正是女性的圍絕經或絕經階段。激素治療是目前治療絕經相關癥狀最有效的方法，它對維持絕經婦女身體健康、提高生活質量具有其他任何單一藥物不能取代的作用。但是目前有研究[2]認為，激素治療會使乳腺癌發生風險增加。婦女經過5年以上的雌/孕激素聯合治療，乳腺癌風險將增加(HR=1.24,95%CI:1.01～1.54)[3]。此外，也有大部分的臨床研究[2-5]顯示，激素治療超過5年，乳腺癌的發病風險增加。

有研究[3]發現，健康女性乳腺內存在惡性細胞的概率是40%，有一部分女性即使在內源性雌激素、孕激素的刺激下，乳腺惡性細胞也可能會發生快速增生而發展為臨床乳腺癌。如能早期檢測雌激素孕、激素、相關乳腺癌風險，篩選出乳腺癌高危患者并采取相應措施，對減少激素治療的乳腺癌風險具有重要指導意義，但是直到現在，臨床上關于乳腺癌風險血清學標志物均缺乏一定的敏感度、特異度。在最近十幾年，發現了一些新的孕激素受體膜組分，其中孕激素受體膜組分1(progesterone receptor membrane components 1， PGRMC1)，雌激素、孕激素聯合治療可以明顯促進PGRMC1表達陽性的乳腺癌細胞的增生，體外研究[4-6]顯示，體外雌激素、孕激素對MCF7/PGRMC1與未轉染PGRMC1的乳腺癌細胞(MCF7)增生作用有明顯不同，雌激素和某些孕激素明顯增加了轉染了PGRMC1的乳腺癌細胞的增生，并可能參與了腫瘤發生。近幾年陸續有關于PGRMC1在實體瘤中表達情況的報道[7-8]，但研究結果不一致，同時這些臨床數據比較零散，研究樣本量小，絕大部分研究集中于評估乳腺癌組織中特定的細胞結構而無法對患者血液中PGRMC1的表達進行檢測和評估，而后者對于激素治療前的常規風險篩查十分必要。本課題組[4]在前期的預實驗研究中已經發現乳腺癌患者血液中PGRMC1表達與乳腺正常參照人群血液中PGRMC1表達差異有統計學意義，發現PGRMC1的表達與乳腺癌發生相關，本研究將進一步通過酶聯免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測血液中PGRMC1濃度，這對預測MHT乳腺癌風險，為激素治療的安全臨床應用具有重要意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 基本情況與分組

按照總體率估計公式[5]，以前期有關研究為參考值[6]，以容許誤差為10%，α=0.05，單側 μα=1.64，來估計要測試的樣本，選取2016年9月至2018年1月期間，因乳腺疾病就診于首都醫科大學附屬北京婦產醫院乳腺外科、中國醫學科學院腫瘤醫院乳腺外科以及解放軍263醫院乳腺外科患者140例，檢測其血清及全血標本。本研究經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準(倫理審批號：IEC-C-18-V04-FJ1)，所有血液來源者均已簽署知情同意書。(1)乳腺癌組：90例，均為女性，年齡23～70歲，年齡中位數為49歲，均經術后臨床病理確診。依據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)腫瘤組織學分類(2003版)[9]為乳腺浸潤性癌90例。根據美國癌癥分析聯合委員會(American Joint Committee on Cancer， AJCC)[10]臨床分期，Ⅰ期24例，Ⅱ期26例，Ⅲ期20例，Ⅳ期20例。(2)乳腺良性疾病組：50例，均為女性，年齡24～64歲，年齡中位數42歲，均經乳腺影像學或乳腺穿刺活檢確診。(3)正常對照組：采用數字表法隨機抽取同期門診健康體檢者30例，均為女性，年齡25～68歲，年齡中位數為40歲。

1.1.2 納入標準

1)乳腺癌：①病理診斷乳腺癌(無論有無淋巴結轉移)；②無其他惡性腫瘤治療史；③所有患者均未經過任何術前針對性治療；④足夠可利用的組織標本。

2)乳腺良性疾病：①乳腺纖維腺瘤；②乳腺導管內乳頭狀瘤；③乳腺囊性增生病。

1.1.3 排除標準

①男性乳腺癌；②術前接受任何形式新輔助化學藥物治療；③靶向治療等的患者；④近3個月內接受激素替代治療者。

1.2 標本采集

患者入院待檢清晨空腹靜脈血10 mL，其中5 mL離心分離血清后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，待測血清CA153、CEA、CA125；另外5 mL至于EDTA-K3抗凝管中，50 μL/管分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱，待測全血PGRMC1。

1.3 測定血清CA153、CEA、CA125

化學發光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay， CLIA)，采用雙抗體夾心法，分析過程全自動化，儀器自動吸樣品50 μL，液相試劑50 μL，固相試劑250 μL，37 ℃溫浴7.5 min，沖洗后，加入反應試劑(堿性過氧化氫)激發反應，其發光強度與樣品濃度成正比。按藥盒說明，以CA125>35 U/mL，CA153>25 U/mL，CEA>5 μg/L為陽性值。

1.4 ELISA法測定全血PGRMC1

取新鮮抗凝血，400～500 g離心5 min，離心棄上清。取900 μL(分2管各450 μL)每管加入9倍體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解時間8～10 min，400～500 g 4 ℃離心5 min，棄紅色上清。加入 3～4 mL PBS洗滌1次，400～500 g離心2～3 min，棄上清。1 mL RIPA 加入10 μL PMSF，使 PMSF的最終濃度為1 mmol/L，混勻備用。將裂解后的樣品10 000～14 000 g 離心3～5 min，取上清。加液器在微孔板每孔分別加標準品或待測樣本100 μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37 ℃溫育2 h。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，37 ℃恒育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。每孔加辣根過氧物酶標記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼， 37 ℃恒育1 h。棄去孔內液體，甩干，吸去或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液按200 μL/孔注入孔內，浸泡2 min；洗板5次，每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL。當肉眼可見標準品前3～4孔有明顯梯度藍色，后3～4孔顯色不明顯時，即可加入終止液終止反應；37 ℃避光顯色15～30 min。依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應。在反應終止后5 min內用酶標儀在450 nm波長依次測量各孔的吸光度(A值)。

1.5 數據處理

PGRMC1檢測將標準品及樣本值減去S0孔數值后繪制曲線，設置復孔則取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標，A值為橫坐標，繪出標準曲線。根據樣本A值，用標準品的濃度與A值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣本的A值代入方程式，計算出樣本濃度。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 PGRMC1濃度在乳腺癌、乳腺良性疾病及正常對照組間比較

血PGRMC1濃度在各組間分布如圖1所示。對照組中，PGRMC1濃度為(39.36±25.10)ng/L；乳腺良性疾病組中，PGRMC1濃度為(42.77±29.81)ng/L；乳腺癌組中，PGRMC1濃度為(74.06±28.76)ng/L，其中Ⅰ期(56.14±15.65)ng/L，Ⅱ期(60.89±16.86)ng/L，Ⅲ期(95.54±16.79)ng/L，Ⅳ期(113.78±41.20)ng/L，各組間PGRMC1濃度差異有統計學意義(P<0.05)。正常對照組與乳腺良性疾病組間差異無統計學意義(P>0.05)；乳腺癌早期(Ⅰ期)與乳腺良性疾病組及正常組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。乳腺癌Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血液PGRMC1濃度隨期別的增加而逐漸升高，顯著高于乳腺良性疾病組及正常對照組(P<0.05)(表1)。

圖1 PGRMC1在組間的分布Fig.1 Blood PGRMC1 level among groups

PGRMC1: progesterone receptor membrane components 1；0: control group;1: benign breast disease group;2: stage Ⅰ of breast cancer；3：stage Ⅱ of breast cancer；4：stage Ⅲ of breast cancer；5：stage Ⅳ of breast cancer.

表1 乳腺良惡性腫瘤血液PGRMC1濃度比較Tab.1 Blood PGRMC1 level in benign and malignant breast tumors

*P<0.05vsbreast benign disease group and control group；PGRMC1: progesterone receptor membrane components 1.

2.2 乳腺良、惡性腫瘤血液中腫瘤標志物水平比較

血清腫瘤標志物(CA125、CA153、CEA)陽性率在3組間表達差異有統計學意義 (P<0.001)。兩兩比較結果顯示，乳腺癌早期患者(Ⅰ期、Ⅱ期)與乳腺良性疾病組及正常對照組相比，CA125、CA153和CEA陽性率差異無統計學意義 (P>0.05)。乳腺癌晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者3種血清腫瘤標志物陽性率均顯著升高，與對照組和乳腺良性疾病組差異有統計學意義(CA125:χ2=12.26，P=0.000; CA153:χ2=28.19，P=0.000; CEA:χ2=6.52，P=0.011；CA125:χ2=16.46，P=0.000; CA153:χ2=42.19，P=0.000; CEA:χ2=14.29，P=0.000)(表2)。

2.3 PGRMC1對乳腺癌的診斷及早期預測價值

以組織病理學診斷為金標準，鑒于CA125、CA153和CEA血清含量在早期(Ⅰ期和Ⅱ期)乳腺癌中無顯著性變化，故將乳腺癌患者分為早期(Ⅰ期和Ⅱ期)50例和晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)40例，分別以正常組作為對照繪制PGRMC1、CA125、CA153、CEA的ROC曲線進行診斷試驗診斷效果的比較(圖2、3)。

表2 不同組別CA125、CA153、CEA表達比較Tab.2 Serum CA125， CA153 and CEA level in different groups n(%)

PGRMC1:progesterone receptor membrane components 1;CA125: carbohydrate antigen 125；CA153: carbohydrate antigen 153；CEA: carcino-embryonic antigen;*P<0.05vsbreast benign disease group and control group.

圖2 晚期乳腺癌中各指標的ROC曲線Fig.2 CA125，CA153，CEA， PGRMC1 diagnosisadvanced breast cancer by ROC curve analysis

ROC:receiver operating characteristic1;CA125: carbohydrate antigen 125;CA153: carbohydrate antigen 153;CEA: carcino-embryonic antigen；PGRMC1:progesterone receptor membrane components 1.

圖3 早期乳腺癌中各指標的ROC曲線Fig.3 CA125，CA153，CEA， PGRMC1 diagnosisearly breast cancer by ROC curve analysis

ROC:receiver operating characteristic;CA125: carbohydrate antigen 125;CA153: carbohydrate antigen 153;CEA: carcino-embryonic antigen；PGRMC1:progesterone receptor membrane components 1.

在乳腺癌晚期診斷中，PGRMC1的AUC為82.7%(P<0.05，95%CI： 0.731～0.923)，CA125的AUC為78.3%(P<0.05，95%CI： 0.677 ～ 0.890)，CA153的AUC為86.8%(P<0.05，95%CI： 0.853 ～ 0.918)，CEA的AUC為77.3%(P<0.05，95%CI： 0.853 ～ 0.918)，在診斷晚期乳腺癌中PGRMC1及3種腫瘤標志物均有一定的參考意義。其中CEA的AUC最大，敏感度為86.8%，特異度為75.0%，對晚期乳腺癌的診斷最有價值，其次為PGRMC1，利用PGRMC1診斷晚期乳腺癌患者的準確性較高(表3)。

在早期乳腺癌的ROC曲線分析中，CA125、CA153和CEA的AUC均小于60%，且對早期乳腺癌的診斷沒有參考意義(P>0.05)。而PGRMC1的AUC為0.688，差異有統計學意義(P<0.05，95%CI：0.853～0.918)，敏感度為94.0%，特異度為50.0%，利用血PGRMC1檢測有助于提高對乳腺癌的診斷性能和早期檢出率(表4)。

3 討論

乳腺癌是危及婦女健康乃至生命的首要原因，2014年Lancet最新數據顯示中國每年乳腺癌新發數量和死亡數量分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。隨著經濟發展、生活方式的改變及人口老齡化增加，在北京、上海等大城市乳腺癌發病率已位居女性所有惡性腫瘤的首位。我國診斷為乳腺癌的高發年齡為45～55歲，其中62.9%的女性被診斷為乳腺癌時還未絕經[11]。由于乳腺癌初期癥狀不明顯，多數患者就診時病情已發展到中晚期，因此提高乳腺癌早期診斷水平，探索良好的早期診斷指標具有重要意義。腫瘤標志物在協助臨床診斷腫瘤、分析病情、指導治療、監測復發或轉移、判斷預后方面有著重要的意義[12]。血清CA153是目前公認的診斷乳腺癌較為特異的腫瘤標志物，最早發現于乳腺癌上皮細胞，是乳腺細胞上皮表面糖蛋白的變異體，細胞癌變時，由于糖基化轉移酶被激活，引起細胞表面糖類的變化，由癌細胞向血循環中釋放。血清CA153常在乳腺癌中過度表達，是監測浸潤性或轉移性乳腺癌的重要標志物。但CA153對診斷早期乳腺癌的敏感度和特異度欠佳，在乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期診斷的敏感度僅有10%～15%、20%～25%，在部分乳腺癌患者中呈陰性表達，并且其濃度與乳腺癌的臨床分期、腫瘤直徑、腋窩淋巴結狀況、雌激素受體密切相關[13-14]。進行性疾病如乳腺癌如果得到早期診斷后，那么啟動治療對患者的生存或生活質量有積極影響。此外，公認或臨床確認的有重要臨床意義的腫瘤標志物目前并無增加。而已證實至少25%的增加，才被解釋為有臨床重要意義。因此CA153在乳腺癌診斷中存在一定的局限性。

表3 PGRMC1、CA125、CA153、CEA表達濃度對晚期乳腺癌診斷效果評價Tab.3 Evaluation of PGRMC1， CA125， CA153 and CEA on diagnosis of advanced breast cancer

PGRMC1:progesterone receptor membrane components 1;CA125: carbohydrate antigen 125;CA153: carbohydrate antigen 153;CEA: carcino-embryonic antigen;AUC: area under the ROC curve;ROC:receiver operating characteristic.

表4 PGRMC1、CA125、CA153、CEA表達對早期乳腺癌診斷效果評價Tab.4 Evaluation of PGRMC1， CA125， CA153 and CEA on diagnosis of early breast

PGRMC1:progesterone receptor membrane components 1;CA125: carbohydrate antigen 125;CA153: carbohydrate antigen 153;CEA: carcino-embryonic antigen;AUC: area under the ROC curve;ROC:receiver operating characteristic.

CA125是一種細胞表面的糖蛋白，最初由乳頭狀漿液囊性卵巢癌中提出。健康成人CA125的上限為35 U/mL，在乳腺癌中有20%血清CA125超過35 U/mL。CA125是上皮性卵巢癌的主要標志物，在非卵巢癌的一些惡性腫瘤中，如肺癌、肝癌、和乳腺癌等，CA125也會出現不同程度的升高[15]。但CA125在乳腺癌的診斷價值方面也稍顯不足，在乳腺癌診斷中的敏感度僅為24.6%～38%[16]。因此，研究[17]表明CA125不能單獨用于乳腺癌的早期診斷和病程反應。

CEA是目前臨床上應用最廣泛的腫瘤標志物之一，但其主要存在于胎兒組織和胃腸道腫瘤中，同時在肺腫瘤疾病中如肝炎、肝硬化中也存在[17]。CEA與CA153一樣，作為一個乳腺癌標志物，CEA的敏感性通常低于CA153，由于CEA的非特異性，常與其他腫瘤標志物聯合應用。綜上，現在的血液學生物標志物在乳腺癌的早期診斷中并無價值，因此，迫切需要一種新型、具有較高敏感度和特異度的血液生物學標志物。

在最近幾十年，人們發現了一種新的乳腺癌細胞膜受體-PGRMC1，此受體為跨膜受體，具有跨膜域和胞質域。前期體外實驗、初步動物實驗及臨床研究[18-20]均說明了PGRMC1與激素誘導的乳腺癌發生、發展有重要的相關性，如果能在應用激素治療前對女性進行PGRMC1的檢測，對表達陽性的女性采取措施，則可以減少激素治療中乳腺癌的風險。但目前的測定方法僅限于組織標本，這種檢測方法是有創的，不利于大規模篩查。

在本研究中，取代蛋白印跡半定量方法，采用ELISA檢測乳腺癌、乳腺良性疾病患者及正常人群全血PGRMC1濃度，并比較了乳腺癌患者組與乳腺良性疾病組和正常組PGRMC1血液陽性檢出率、陽性水平的差異情況，發現不同組別中PGRMC1均有不同程度的表達，乳腺癌組與對照組和良性疾病組相比，PGRMC1濃度明顯升高，且在不同期別中表達水平明顯不同。而臨床常用的腫瘤標志物CA125、CA153、CEA雖在Ⅲ、Ⅳ期表達顯著升高，但在I、Ⅱ期乳腺癌中雖然表達水平有所升高，但與正常組和乳腺良性疾病組比較,差異無統計學意義(P>0.05)，提示CA125、CA153和CEA在乳腺癌早期診斷中意義不大，這與以往報道[21-23]基本一致。

本研究應用ROC曲線評價CA153、CEA、CA125診斷晚期乳腺癌(Ⅲ、Ⅳ期)ROC曲線下面積均>70%，表明其作為晚期乳腺癌臨床診斷標志物具有一定的參考價值，而早期乳腺癌中3種腫瘤標志ROC曲線下面積在幾乎在0.5以下，敏感度、特異度均較低，對早期乳腺癌診斷幾乎沒有意義。而PGRMC1在早晚期乳腺癌中ROC曲線下面積分別為68.8%和82.7%，這與乳腺癌組織中PGRMC1表達情況具有較高的一致性[5]。當截取值為39.49 ng/L和75.35 ng/L時，PGRMC1預測乳腺癌的敏感度及特異度最高，有望成為激素治療前常規篩查的乳腺癌風險標志物。

本研究的局限性在于：①本研究只是對PGRMC1及腫瘤標志物檢測在乳腺癌診斷中的臨床價值進行評價，而未進行乳腺癌術后隨訪，從而未能將PGRMC1對乳腺癌術后監測中復發、轉移中的評價指標進行分析，在接下來的實驗中，本課題組將對乳腺癌患者進行術后隨訪12～36個月，并定期對乳腺癌復發轉移患者監測PGRMC1及相關腫瘤標志物，ROC曲線下面積評價PGRMC1在監測乳腺癌術后復發或轉移中的應用價值，為PGRMC1成為乳腺癌血液生物學標志物奠定基礎；②本研究雖然找到了PGRMC1的最佳診斷分界點，但樣本量較少，如果要在臨床上應用，需要通過龐大的樣本量來確定。

綜上所述，PGRMC1在不同期別尤其是早期乳腺癌患者中的診斷價值優于臨床常規腫瘤標志物CA125、CA153和CEA，可以盡早篩選出激素用藥前存在乳腺癌發生風險的患者并及時做出評估和干預，同時對提高乳腺癌的早期診斷、早期治療具有重要的參考價值。如果能將PGRMC1作為早期、快速檢測的指標，可以在未來建立一套關于PGRMC1對乳腺癌風險早期評估的預測系統，這將為指導臨床激素治療的安全應用奠定基礎。