ACE2/Ang(1-7)對小鼠脂肪組織脂肪合成的影響

馬池發 史婷婷，2 劉敬怡，2 宋麗妮，2 馮建萍，2 袁明霞，2* 楊金奎，2

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科，北京100730；2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730)

腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)經典作用是調節血壓及維持水電解質平衡，近年來研究[1-4]證實RAS系統參與調解糖代謝及脂代謝。RAS系統新發現的成員血管緊張素轉化酶 2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)，可將血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)分解為血管緊張素(1-7)[angiotensin (1-7)， Ang(1-7)]，后者通過Mas受體發揮作用，形成ACE2/Ang(1-7)/Mas軸與經典的ACE/AngⅡ/AT1軸相拮抗。脂肪組織是胰島素作用的重要的靶器官，也是重要的內分泌器官，能分泌多種細胞因子、激素影響糖脂代謝。RAS系統的成員在脂肪組織表達[5]，并參與調解脂肪組織脂代謝，AngⅡ促進脂肪合成[6]，促進脂肪細胞釋放炎性反應因子[7]。但是ACE2/Ang(1-7)對脂肪組織脂代謝的作用目前研究較少。本研究選用兩種不同的動物模型，研究ACE2/Ang(1-7)對脂肪組織脂肪合成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取雄性8周齡ACE2基因敲除(angiotensin-converting enzyme 2-knockout，ACE2KO)小鼠8只，以體質量相當的雄性8周齡C57BL/6 (wild-type，WT)小鼠8只作為對照，給予高脂飲食[20%(質量分數)蛋白、35%(質量分數)碳水化合物、45%(質量分數)脂肪]飼養。

選取體質量接近的雄性8周齡2型糖尿病db/db小鼠，采用數字表法隨機分為3組，每組8只，予普通飲食。于無菌條件下皮下植入ALzet 微量泵(型號1002)，分別給予A779[D-Ala7-Ang(1-7)](500 μg·kg-1·d-1)、Ang(1-7)(500 μg·kg-1·d-1)+A779 (500 μg·kg-1·d-1)以及相同劑量的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液干預4周。Ang(1-7)(貨號H1715)及A779(貨號H2888)購于瑞士Bachem公司。

所有動物購于南京大學模式動物研究所，實驗所使用動物均經過首都醫科大學附屬北京同仁醫院動物委員會批準。動物飼養環境為SPF級別，自由攝水，每天光照12 h。 溫度18～23 ℃，濕度50%～60%，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2005-0001。

1.2 檢測體質量、取材、計算體脂率

飼養4周后測小鼠體質量。將小鼠斷頸處死，PBS灌流組織，留取附睪脂肪及皮下脂肪稱質量，計算小鼠體脂率(脂肪質量與體質量之比)。

附睪脂肪同一部位放入4%(質量分數)多聚甲醛固定以做HE染色，剩余部分放入液氮轉入-80 ℃冰箱凍存留作Western blotting法檢測。

1.3 血脂測定

小鼠處死前毛細管內眥取血800 μL，4 ℃ 4 000 r/min 離心10 min，留取血清測血脂。血漿三酰甘油(triglyceride，TG)測定采用GPO-PAP法?？偰懝檀?total cholesterol，TC)測定采用CHOD-PAP法。 試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司。分別對標準品、對照品和待測樣品進行測量，采用Bio-Rad酶標儀讀取測定。

1.4 附睪脂肪組織HE染色

附睪脂肪組織4%(質量分數)多聚甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、制成5 μm石蠟切片，HE 染色后顯微鏡下觀察。

1.5 Western blotting法檢測

用RIPA強裂解液(加入PMSF100X，Cocktail25X)裂解小鼠附睪脂肪，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至PVDF上，用含5%(質量分數)脫脂奶粉的TBST溶液封閉1.5 h，加入稀釋的一抗于 4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5～10 min，加入 1∶2 000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，肌動蛋白(β-actin)為內參，滴加增強化學發光法(enhanced chemiluminescence,ECL)化學發光液，用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統顯影成像，并用Image Lab 軟件灰度分析。乙酰輔酶A 羧化酶ɑ(acetyl-CoA carboxylase ɑ，ACCɑ)抗體購于美國Santa Cruz公司(貨號Sc-30212)，β-actin(貨號8457)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)抗體(貨號3180) 抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。脂肪型脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，aP2)(貨號ab23693)抗體購于英國Abcam公司。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 ACE2敲除后對小鼠體質量及體脂率的影響

高脂飲食喂養小鼠4周后，ACE2 基因敲除小鼠與野生對照小鼠相比，體質量無明顯變化；肉眼觀察脂肪組織大體標本，ACE2基因敲除鼠脂肪量明顯多于野生對照鼠；體脂率測定明顯高于野生對照鼠(P<0.05)(圖1)。

2.2 ACE2敲除后對小鼠血脂的影響

高脂飲食喂養小鼠4周，ACE2基因敲除小鼠血清TG濃度較對照組明顯升高(P<0.05)，TC濃度在兩組間比較，差異有統計學意義(圖2)。

2.3 ACE2敲除后對小鼠附睪脂肪細胞形態學的影響

HE染色結果顯示，野生對照小鼠附睪脂肪細胞排列較緊密，細胞邊緣較清晰；ACE2基因敲除鼠附睪脂肪細胞體積與對照小鼠相比增大，且細胞邊緣更模糊(圖 3)。

A：weight;B:adipose tissue of WT mice;C:adipose tissue ofACE2KO mice;D:body fat percentage;*P<0.05，n=6;WT：wild type；ACE2:angiotensin-converting enzyme 2;ACE2KO:angiotensin-converting enzyme 2-knockout.

圖2 ACE2基因對小鼠血脂的影響Fig.2 Effect of ACE2 gene on serum cholesterol andtriglyceride in mice

A:TG;B:TC;*P<0.05，n=6.ACE2:angiotensin-converting enzyme2;ACE2KO:angiotensin-converting enzyme2-knockout；TG：triglycerides；TC：total cholesterol；WT：wild type.

圖3 ACE2基因敲除鼠和野生鼠附睪脂肪細胞HE染色Fig.3 Hematoxylin and eosin staining of epididymaladipocytes in ACE2KO and WT mice(HE,400×)

A：epididymal adipocytes of WT mice；B：epididymal adipocytes ofACE2KO mice；WT：wild-type；ACE2：angiotensin-converting enzyme 2 ；ACE2KO：angiotensin-converting enzyme2-knockout.

2.4 ACE2基因敲除后對附睪脂肪合成因子的影響

Western blotting法檢測結果示，ACE2基因敲除鼠附睪脂肪ACCα、FAS的蛋白表達高于野生對照小鼠，差異有統計學意義，ACE2基因敲除鼠的aP2蛋白表達有高于野生對照小鼠的趨勢，差異無統計學意義(P>0.05, 圖4)。

圖4 ACE2基因對小鼠附睪脂肪組織脂肪合成因子蛋白表達的影響Fig.4 Effect of ACE2 on the lipogenesis related genesexpression in epididymal adipose tissue of mice

A：representative Western blotting for ACCɑ，FAS and aP2；B：statistical analysis for protein level；ACE2：angiotensin-converting enzyme 2；ACE2KO：angiotensin-converting enzyme2-knockout ；WT：wild-type；ACCɑ：acetyl-CoA carboxylase ɑ；FAS：fatty acid synthetase；aP2：adipocyte fatty acid binding protein；*P<0.05.

2.5 Ang(1-7)對db/db小鼠體質量的影響

Ang(1-7)皮下泵干預小鼠4周后，小鼠體質量與0.9%(質量分數)氯化鈉注射液處理組相比沒有明顯變化。應用Ang(1-7)的拮抗劑A779拮抗Ang(1-7)后對體質量無明顯影響(圖5)。

圖5 Ang(1-7)及Ang(1-7)+A779干預對小鼠體質量的影響Fig.5 Effect of Ang(1-7) and Ang(1-7)+A779 onbody weight in db/db miceAng(1-7)：angiotensin (1-7); A779: D-Ala7-Ang(1-7).

2.6 Ang(1-7)對db/db小鼠附睪脂肪合成因子的影響

Ang(1-7)干預db/db小鼠4周后， 其附睪脂肪ACCα及FAS蛋白的表達較0.9%(質量分數)氯化鈉注射液處理組下調，加用Ang(1-7)的拮抗劑A779干預后ACCα及FAS蛋白的表達較Ang(1-7)干預組上調，差異有統計學意義(圖6)。

圖6 Ang(1-7)、Ang(1-7)+A779干預對db/db小鼠附睪脂肪組織脂肪合成因子蛋白表達的影響Fig.6 Effect of Ang(1-7),Ang(1-7)+A779 onlipogenesis related genes expression in epididymaladipose tissue of db/db mice

A:representative Western blotting for ACCɑ and FAS;B:statistical analysis for protein level;Ang(1-7): angiotensin(1-7);A779: D-Ala7-Ang(1-7);ACCɑ：acetyl-CoA carboxylase ɑ；FAS：fatty acid synthetase；*P<0.05，**P<0.01.

3 討論

哺乳動物白色脂肪組織主要功能是以TG的形式存貯能量，同時它也是重要的內分泌器官，分泌激素、細胞因子等通過自分泌、內分泌、旁分泌方式發揮作用[8]。白色脂肪在高血糖、高血壓、脂代謝紊亂、肥胖等代謝綜合征及胰島素抵抗發生中起重要作用。肥胖患者中RAS系統是過度激活的[9]，與胰島素抵抗密切相關。研究[10]表明，RAS系統中ACE2/Ang(1-7)/Mas軸拮抗ACE/AngⅡ/AT1軸的作用。ACE/AngⅡ/AT1軸的經典作用有收縮血管，引起醛固酮的釋放、保鈉、保水，近年來更多的研究[1， 11]是關注其對糖脂代謝的影響。Ang(1-7)可對抗AngⅡ的血管收縮、促纖維化、促生長效應[12]，可改善脂肪細胞氧化應激，增加葡萄糖攝取[13]。

目前關于RAS對脂肪代謝的影響有一些相關報道。AngⅡ可通過AT1受體抑制脂肪細胞分化[14]和脂肪分解[11]，缺乏AT1a受體可減輕飲食誘導的肥胖[15]，但是目前ACE2/Ang(1-7)/Mas軸對脂肪代謝并沒有深入探討。有研究[16]表明，Ang(1-7)能上調FAS、ACC、aP2等因子表達促進脂肪細胞形成，也有研究[17-18]證實ACE2受體激動劑三氮脒(diminazene aceturate，DIZE)下調ACCα及FAS等因子抑制脂肪合成。為了更加明確ACE2/Ang(1-7)對脂肪合成的影響，本研究中選用ACE2敲除及2型糖尿病db/db小鼠兩種動物模型，以其附睪脂肪作為白色脂肪的代表，正反兩方面論證ACE2/Ang(1-7)對白色脂肪組織脂肪合成的影響。結果發現，ACE2基因敲除后，小鼠的體脂率及血脂濃度明顯升高，同時，Western blotting法檢測結果顯示ACE2敲除后脂肪合成關鍵因子ACCα及FAS的蛋白表達升高。這些結果表明，ACE2敲除后小鼠的脂肪合成是上調的。本研究同時應用Ang(1-7)干預2型糖尿病db/db小鼠，發現Ang(1-7)抑制了附睪脂肪組織脂肪合成因子的表達，同時這一作用被Ang(1-7)的拮抗劑A779所拮抗。這一發現與ACE2基因敲除小鼠的結果相吻合。

本研究證明了ACE2/Ang(1-7)對白色脂肪合成的抑制作用，但是仍有不足之處：(1)Ang(1-7)的受體主要為Mas受體，本研究未針對Mas受體對脂肪代謝的影響進行研究。下一步本課題組將構建Mas基因敲除小鼠進一步研究Mas基因對小鼠脂肪組織脂代謝的影響。(2)本實驗選用ACE2基因敲除小鼠，不排除器官之間相互影響，課題組擬構建ACE2脂肪特異性敲除小鼠進一步研究脂肪組織局部RAS對脂代謝的影響。

綜上所述，本研究結果表明， ACE2/Ang(1-7) 抑制小鼠白色脂肪組織的脂肪合成，其機制可能是通過抑制脂肪合成關鍵因子的表達發揮作用。這一結果對研究RAS系統參與胰島素抵抗發生的機制及發現改善胰島素抵抗的新靶點可能提供新的思路。