北京地區孕晚期婦女定植B族鏈球菌耐藥狀況與血清型分布情況分析

李 東 張樹琛 時琰麗 李雪清 魯炳懷

(民航總醫院檢驗科， 北京 100123)

無乳鏈球菌，又稱為B族鏈球菌(group BStreptococcus，GBS)，可定植于孕產婦的下消化道與泌尿生殖道，其攜帶率與種族、地區與個體因素(如年齡、孕產次)有關[1]，國外文獻[2]顯示的定植率為10%～30%。自20世紀70年代以來，GBS感染后引起新生兒異常受到廣泛的重視。GBS定植后，可通過宮頸口上行，侵入后致宮內感染，是圍產期新生兒重要的致病菌。即使患者沒有宮內感染，經陰道分娩的新生兒，如母體生殖道或直腸攜帶GBS，分娩過程中50%新生兒可攜帶該菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥、新生兒肺炎等疾病。美國疾控中心(Centers for Disease Control，CDC)[2]于2010年推出的《圍產期GBS疾病預防指南》中，明確指出對35～37孕周的婦女進行陰道/直腸GBS定植篩查。

在我國，由于孕產婦人群常規篩查GBS并未大規模普及，國內相關研究資料不全，而根據本實驗室研究[3]表明，增菌后的聚合酶鏈反應GBS檢測陽性率9.6%，低于國外文獻[4-7]的定植水平。為了解北京地區的GBS的分子流行病學特征與對常用抗菌藥物的耐藥菌譜情況，以便向臨床醫師提供有效的預防與診治，為制訂符合本國情況的孕產婦宮內感染預防與診治指南的確定提供臨床與實驗室的依據。

1 資料與方法

1.1 GBS菌株收集與鑒定

收集 2016年 7月-2017 年 6月，在民航總醫院及北京華府婦兒醫院就診，接受產前檢查的孕晚期婦女陰道/直腸拭子所培養出的GBS菌株，每月取檢出的前8株，共96株。其中民航總醫院的菌株有82株，北京華府婦兒醫院收集菌株有14株。菌株的鑒定依據菌落形態(血平皿上呈圓形、邊緣整齊、濕潤、灰白半透明菌落，多數有典型β-溶血環)，顯微鏡下形態(革蘭陽性鏈狀球菌)，CAMP實驗陽性，初步確定是否為GBS，最終采用VITEK-2微生物鑒定儀鑒定。

1.2 GBS菌株血清學鑒定

目前依據GBS上莢膜多糖的不同，分為Ia、Ib、Ⅱ～Ⅸ等10個血清型。采用PCR方法對其進行鑒定。具體引物見表1[4-5]，經基因測序驗證無誤后使用。

1.3 藥敏質控標準

質控菌株選擇ATCC 25923金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌 ATCC 49619、ATCC 27853銅綠假單胞菌，質控菌株來源于實驗室保存。

1.4 抗菌藥物選擇

上述96株菌均進行藥敏實驗，選用的抗生素包括青霉素、氨芐西林、紅霉素、克林霉素與萬古霉素等，采用微量肉湯法進行藥敏表型試驗，藥敏結果解釋參照美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的2017年標準。

1.5 檢測方法

對所有分離到的目標病原菌，用無菌0.9%(質量分數)氯化鈉注射液配置成0.5麥氏濁度的懸液，按照試劑說明書操作，試劑由天津金章科技發展有限公司提供。

表1 GBS 用于血清型鑒定引物與片段長度Tab.1 Primers and amplified fragment length for the serotype identification of group B Streptococcus

1.6 紅霉素耐藥菌株誘導克林霉素耐藥檢測

紅霉素耐藥和克林霉素敏感或中介的GBS，采用紙片擴散法進行D-抑菌圈試驗。15 μg 紅霉素紙片和 2 μg 克林霉素紙片間距12 mm，35 ℃孵育16～18 h后，與紅霉素相鄰側抑菌圈邊緣出現“截平”(稱作D-抑菌圈)=誘導克林霉素耐藥。在克林霉素抑菌圈內有霧狀生長=克林霉素耐藥，即使無明顯的D-抑菌圈。誘導克林霉素耐藥試驗陽性，應報告分離株“克林霉素耐藥”。

1.7 耐藥基因檢測

針對紅霉素耐藥菌株，提取全基因組，耐藥基因與所用引物如表2所示，PCR擴增產物經測序后與BLAST基因數據庫在線比對。

2 結果

2.1 篩查GBS菌株血清學分布

96株無乳鏈球菌，最常見的血清型為Ⅲ型(40株，41.7%)，其他血清型V型(18株，18.8%)， Ia型(13株，13.5%)，Ib型 (13株，13.5%)， Ⅱ型 (8株，8.3%)。有4株GBS，PCR法無任何目標條帶，為無法分型菌株(nontypeable，NT)，菌株藥敏分布見表3。

2.2 抗生素耐藥表型

根據藥敏結果表明，所有菌株均對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、頭孢噻肟敏感。71%(68株)GBS對于紅霉素耐藥，69%(66株)對于克林霉素耐藥。紅霉素耐藥菌株中，有63株(65.6%)為cMLSB型，2株(2.1%)為iMLSB 型，M型有5株(5.2%)，L型有3株(3.1%)，而S型占23株(表4)。

2.3 大環內酯耐藥基因型分析

經耐藥基因檢測分析后發現，紅霉素的耐藥主要與ermB基因相關，有81.4%紅霉素耐藥菌株攜帶該基因。

3 討論

GBS早期稱為無乳鏈球菌，因其最早被確認為是牛乳腺炎的重要致病菌，感染該菌牛奶產量下降，故此得名。20世紀70年代以來，GBS被認為是侵入性新生兒感染的首要致病菌，引起廣泛重視[2]。GBS可定植于孕產婦的生殖道/直腸部位，定植可達率10%～30%[2，8]。孕產婦定植GBS是引起新生兒侵襲性感染的首要危險因素。特別是在歐美等發達國家，GBS是新生兒敗血癥的首位病原菌[9]。

表2 菌株藥敏分布類抗生素耐藥基因與PCR引物Tab.2 Resistance genes and amplification primers of macrolides in group B Streptococcus

表3 96株定植無乳鏈球菌菌株藥敏與MIC值分布Tab.3 Antimicrobial susceptibility testing results and MIC distribution of 96colonized strains of group B Streptococcus

表4 無乳鏈球菌對紅霉素耐藥表型、基因型與血清型相關關系Tab.4 Relationship between erythromycin resistant phenotypes， genotypes and serotypes of group B Streptococcus

MLSB:resistant to macrolides， lincosamides， and streptogramin B. MLSB can be either inducible (iMLSB) or constitutive (cMLSB)

研究[10-13]表明，對于孕晚期婦女生殖道/直腸進行GBS定植篩查，篩查陽性人群在分娩前4 h采用抗生素預防感染，可有效降低新生兒感染的發生率。在美國，近十余年來的孕產婦GBS篩查預防新生兒感染指南的推廣，使得GBS感染下降顯著[2]。

然而，目前為止，中國大陸地區孕產婦人群生殖道/直腸定植GBS的情況研究較少，定植、感染等相關數據相對缺少，亦未制訂相關預防指南[13]。因此，本研究中對于位于北京東部地區產科就診的人群進行生殖道/直腸定植GBS定植情況篩查，以了解國內GBS菌株的分子流行病學趨勢。

實驗研究結果表明，國內人群的GBS血清學分布具有如下特征：血清型Ⅲ為最多見的血清型，占所有菌株的41.8%，該數據遠高于世界上其他國家的報道，僅有一篇來自韓國的報道[10]與此相近(該報道中血清型Ⅲ占43.8%)；V型、Ia型、Ib型與 Ⅱ型血清型的分布僅次于血清型Ⅲ型。研究中未見血清型Ⅳ型、Ⅳ型、VⅡ型或 IX型、這兩種血清型在其他亞洲人群進行的研究中亦較少見[11-12]。

目前的指南[2，9]多推薦采用青霉素對于GBS定植的孕產婦在分娩前預防該菌引起的新生兒感染。歐美等國家目前尚未見青霉素耐藥的GBS菌株。但是，亞洲部分地區，已報道[9，14]發現對于青霉素或氨芐西林中介的GBS菌株。本研究中96例GBS菌株均對青霉素與氨芐西林敏感，說明在中國β-內酰胺抗生素依然可作為GBS定植人群預防感染的首要選擇。

美國CDC指南[2]亦指出，對于青霉素過敏的孕婦，可采用紅霉素或克林霉素替代，然而GBS對于紅霉素與克林霉素的耐藥率不斷上升，引起世界范圍內的廣泛關注[15]。GBS對大環內酯獲得性耐藥是通過erm基因(主要為ermB、ermTR)編碼的23S rRNA基因甲基化，使大環內酯與靶位結合力下降引起MLSB表型耐藥。本研究中發現，國內GBS對紅霉素與克林霉素的耐藥率(分別為70.8%與68.8%)高于歐美國家的耐藥率。同時，表型為cMLSB的GBS菌株占總耐藥菌株的首位，而M表型僅占紅霉素耐藥菌株的5.2%。本研究中發現的GBS對紅霉素與克林霉素的耐藥率如此之高，表明對于青霉素過敏的患者，采用紅霉素或克林霉素作為替代抗生素預防時，必須進行藥敏實驗。Morozumi等[12]建議，對于大環內酯或林可霉素耐藥的GBS菌株，應采用萬古霉素進行預防。

總之，本研究結果表明北京地區的GBS菌株的分子流行病學特征與世界其他國家的報道總體相仿，但有其自身特點：①血清型Ⅲ為最多見的血清型；②克林霉素與紅霉素耐藥極高；③未見青霉素與萬古霉素耐藥的菌株。