高產納豆激酶菌株的分離與發酵納豆過程中生物胺的變化

高澤鑫，何臘平,2,*，劉亞兵，高 冰，李翠芹，劉涵玉

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；4.貴州大學化學與化工學院，貴州 貴陽 550025）

納豆起源于中國，是傳統的發酵食品，唐朝時期傳入日本，有1 000 a以上食用歷史[1]。納豆類似中國的豆豉，主要經枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵而來，日本將納豆作為營養食品和調味品[2]，我國主要將豆豉用鍋蒸煮或炒后作為調味料。日本學者Sumi等[3]于1987年首次對納豆及其提取物作了系統研究，并找到了具有纖溶活性的納豆激酶。據報道，全球每年因患血栓類疾病死亡的人數多達1 200萬，而中國約占總數的1/5[4]，因此關于溶栓的藥物開發成為了現在研究的熱點。由于納豆激酶具有高效溶栓作用，因此受到了各界的廣泛關注[5]。產納豆激酶菌株的來源有很多，如日本納豆食品中、一些海洋生物中、中國臺灣的土壤中、中國的豆豉和亞洲發酵蝦醬中[6-10]，也可能存在于傳統發酵的肉食品中。

食品中的生物胺主要通過微生物脫羧酶的作用生成含氮化合物[11]。口服攝入生物胺通常不會引起不良反應，因為人體腸道中有大量胺氧化酶能快速代謝含氮化合物，所以多數生物胺在人體中沒有直接的毒性[12]。然而，如果生物胺代謝能力過飽和或代謝活性被特異性抑制劑減弱，則可能發生食物中毒[13]。常見的中毒癥狀有惡心、呼吸困難、潮熱、出汗、神經過敏、頭痛、明亮的紅色皮疹、口腔燒灼感、低滲或高血壓，這主要是由組胺、酪胺和β-苯乙胺引起[14]。據報道，在食品中組胺含量100 mg/kg被認為是人類食用的上限，而酪胺含量100～800 mg/kg和β-苯乙胺含量達到30 mg/kg是有毒劑量[15]。目前測定食品中生物胺含量的方法很多[16-17]，如毛細管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法等，而本實驗采用高效液相色譜-紫外檢測的方法來測定發酵納豆中生物胺的變化情況。

本研究通過酪蛋白平板和纖維蛋白平板篩選法從貴州織金特色農家土制煙熏臘肉中分離出1 株高產納豆激酶菌株，并采用生理生化和分子生物學的方法對菌株進行鑒定[18]。分離于傳統食品中的微生物一般不存在安全性問題，但產納豆激酶的菌株一般會產生物胺。所以本研究在分離的菌株鑒定的基礎上，接著以黃豆為主要碳源，對其進行純種固態發酵，檢測其在發酵過程中產生物胺的變化、產生的納豆激酶活力和生物量變化情況，探討菌株產生物胺的安全性問題，為納豆的工業化生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

1.1.1 材料

黃豆為市售有機黃豆；菌株篩選樣品為貴州織金農家土制煙熏臘肉。

1.1.2 試劑

牛凝血酶（1 000 U/g）、牛纖維蛋白原 沈陽拜英生物技術有限公司；尿激酶生物標準品（1 240 IU/g）中國食品藥品檢定研究院；細菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；生物胺標準品：色胺、組胺、精胺、2-苯乙胺、腐胺、亞精胺、尸胺、酪胺、丹磺酰氯 美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

篩選培養基：干酪素5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母膏1 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7；液體種子培養基：葡萄糖10 g/L，酵母提取物5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl5 g/L，pH 7；斜面培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7；平板計數培養基：蛋白胨5 g/L、酵母浸粉 2.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7；固態發酵培養基：黃豆清洗干凈，加入4 倍體積的去離子水浸泡，常溫浸泡18 h，瀝水后加入3%食鹽和3%蔗糖。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-10超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；LS-B75L立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；DW-86L286立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 上海新苗醫療器械制造有限公司；SPX生化培養箱 上海科恒實業發展有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設備廠；S1000TM聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Thermal Cycler公司；Gel Doc XR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TS-2102C恒溫振蕩器 上海天呈儀器有限公司；1100高效液相色譜儀及檢測器、SB-C18色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆激酶活力測定

納豆激酶活力測定采用Astrup等[19]的方法，并對尿激酶標準品配制進行改進。將尿激酶標準品配制為248、496、744、992、1 240 IU/mL，各取10 μL點樣于纖維蛋白原平板孔中，放入恒溫培養箱中37 ℃孵育18 h后取出，測定溶解圈的面積。以溶解圈的面積（mm2）為橫坐標，以尿激酶活性為縱坐標作標準曲線。樣品的進樣方法與標準品的方法相同，將孵育完的纖維蛋白原平板用游標卡尺測定溶圈的直徑并計算各溶圈面積，根據尿激酶標準曲線測得樣品納豆激酶活力。

1.3.2 高產納豆激酶菌株的篩選

將臘肉切碎制成樣品懸液用8.5%的生理鹽水10 倍梯度稀釋，取10-7、10-8、10-9三個稀釋度涂布于酪蛋白平板上。由于納豆激酶是堿性絲氨酸蛋白酶，可水解酪蛋白形成透明圈，根據這一特性在37 ℃條件下倒置培養24 h后挑取出形態不同且有明顯水解透明圈的菌落，進行純化后接種到斜面培養基上4 ℃冰箱保存備用。用接種環挑選2～3 環斜面培養基上的菌苔接種到液體種子培養基中，在37 ℃、180 r/min的條件下培養24 h。培養完成后于4 ℃、12 000×g離心10 min。將粗酶液進行納豆激酶活力測定。

1.3.3 菌株形態與生理生化鑒定

將篩選得到的酶活力最高的菌株在酪蛋白平板上畫線，37 ℃倒置培養24 h，觀察單菌落形態，對菌株進行革蘭氏染色正文，觀察菌體形態。根據文獻[20]對菌株進行生理生化鑒定。考察其對色氨酸、蔗糖、苦杏仁苷等的利用情況。

1.3.4 菌株分子鑒定

菌株活化后使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取。擴增使用的上游引物為27F，下游引物為1492R。25 μL反應體系為模板DNA2 μL；27F 2.5 μL；1492R 2.5 μL；Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL；去離子水5.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火溫度從65 ℃降至55 ℃，每個循環降低0.5 ℃，退火時間為3 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；恒定退火溫度下進行94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。PCR產物送上海生工公司雙向測序，將雙向測序結果通過DNA man軟件進行拼接，再登錄NCBI將所得序列結果與數據庫中的已知序列進行相似性比對，采用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

1.3.5 納豆固態發酵

挑選顆粒飽滿、無畸形、色澤淡黃的市售有機黃豆，用去離子水沖洗，直至無雜物，豆水質量比1∶4浸泡18 h后，瀝干水后分裝入三角瓶各50 g，再向每瓶加入1.5 g食鹽和1.5 g的蔗糖。放在高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮15 min，隨即放入超凈工作臺內冷卻。挑取2～3 環菌苔接種到液體種子培養基中，于37 ℃、180 r/min的條件下培養18 h，然后按4%的接種量接種到冷卻好的固態發酵培養上，37 ℃培養72 h，每12 h搖晃一次。

1.3.6 固態發酵生物量與酶活力分析

在納豆固態發酵期間，每隔6 h取納豆樣品，稀釋涂布于平板計數培養基上，37 ℃倒置培養18 h，統計單菌落個數，計算生物量，每個時間點做3 個重復。同時發酵期間每6 h測定納豆激酶活力。稱取2 g納豆于10 mL離心管中加6 mL無菌的生理鹽水，4 ℃浸提24 h，用玻璃棒搗碎經12 000×g離心10 min，上清液即為固態發酵粗酶液。

1.3.7 生物胺樣品前處理

將每隔6 h取的固態發酵剩余樣品用研缽研磨均勻，準確稱取10 g樣品置于50 mL離心管中，加入25 mL 0.4 mol/L高氯酸，振蕩提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。將沉淀如上述方法再加入25 mL高氯酸連續提取3 次，合并4 次上清液，最后用0.4 mol/L高氯酸定容至100 mL容量瓶。

1.3.8 生物胺標準溶液制備與樣品衍生

生物胺標準溶液的配制參照GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測定》[21]。取0.5 mL標準溶液于10 mL離心管中，依次加入100 μL2 mol/L氫氧化鈉溶液、150 μL飽和碳酸氫鈉溶液緩沖，再加入1 mL丹磺酰氯衍生劑（5 mg/mL，溶劑為丙酮），振蕩混勻后在避光條件下60 ℃水浴30 min，15 min時振蕩一次。加入50 μL 25%氨水終止衍生反應，避光靜置30 min，加入700 μL乙腈溶液混勻，用0.22 μm有機濾頭過濾，于4 ℃避光保存，用于高效液相色譜測定。樣品溶液衍生的條件及方法與標準溶液相同。

1.3.9 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18，紫外檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流動相A為乙腈，流動相B為去離子水，流速為0.8 mL/min，采用的洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

2 結果與分析

2.1 高產納豆激酶菌株的篩選

通過將煙熏臘肉樣品進行稀釋涂布，再經酪蛋白平板篩得18 株形態不同且有明顯透明圈的菌落，選取水解透明圈最大的7 株菌進行純化。將純化好的7 株菌液態發酵，取上清粗酶液注入瓊脂糖-纖維蛋白原平板中，測定其溶圈面積，計算酶活力，結果見圖1。

圖1 高產納豆激酶菌株篩選結果Fig.1 Screening of high-yield nattokinase-producing strain

從圖1可以看出，GULR06的產酶能力最高，其液態發酵24 h后的納豆激酶活力達到（2 793±53）IU/mL。其次為GULR07活力達到（2 431±65）IU/mL。由此選定GULR06為納豆激酶高產菌株，進行鑒定。

2.2 高產菌形態學及生理生化鑒定

圖2 GULR06的菌落形態（A）和革蘭氏染色圖（B）Fig.2 Colony (A) and Gram-staining (B) of strain GULR06

由圖2A可知，GULR06菌落在酪蛋白平板上形成圓形、低凹起、有黏性的小菌落，其顏色呈乳白色，邊緣規則，無光澤，稍隆起，不透明，菌落直徑2.0～2.9 mm。該菌株革蘭氏染色菌體為紫色，為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，單個、成對或鏈狀排列，芽孢中生或近中生，初步判斷為芽孢桿菌屬，其革蘭氏染色菌體形態見圖2B。

對菌株GULR06進行部分生理生化特征實驗。該菌株不能發酵半乳糖、乳糖、衛茅醇、松叁糖、巖糖、塔格糖、鼠李糖，阿東醇、阿拉伯糖醇和木糖醇，同時不能與色氨酸發生發應。參照文獻[20]對枯草芽孢桿菌的描述，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌，菌株GULR06的生理生化鑒定結果見表2。

表2 菌株GULR06的生理生化鑒定結果Table2 Identif i cation of strain GULR06

2.3 分子生物學鑒定及系統發育樹構建

PCR產物擴增片段送上海生工基因公司雙向測序，將雙向測序結果通過DNA man軟件進行拼接后顯示GULR06菌株16S rDNA全長為1 461 bp。BLAST分析結果顯示該基因同枯草芽孢桿菌的16S rDNA基因相似度達到100%。通過MEGA 5.0軟件與同屬親緣關系較近的模式菌株進行同源性分析并構建系統發育樹，結果如圖3所示。系統發育學分析結果表明，該系統發育樹以萊西式菌FJ426598作為一個單獨的外群種，其中GULR06菌株與枯草芽孢桿菌KY123872.1菌株在同一分支，結合前面的形態學和生理生化鑒定結果，最后鑒定GULR06為枯草芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列同源性的菌株GULR06的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain GULR06

2.4 納豆發酵中生物量變化及產酶特性

圖4 納豆發酵中菌株生物量及納豆激酶活力的變化Fig.4 Changes in biomass and nattokinase biosynthesis during natto fermentation

如圖4所示，將菌株GULR06用于納豆固態發酵，表現出了細菌生長的一般規律，從生物量曲線上可以看出，0～12 h內為延滯期，該階段時間較短；12～42 h為對數生長期，活菌數由8.53（lg（CFU/g））增加至14.03（lg（CFU/g）），此階段菌株GULR06大量繁殖，在42 h時活菌數達到固態發酵中的最高值；42～48 h內是穩定期；48 h之后是衰亡期。由納豆激酶相對活力變化曲線可以發現，隨著菌體生長，納豆激酶才被逐漸合成。54 h時，納豆激酶活力達到最高，為（5 439.5±149）IU/g，此時活菌數已降至13（lg（CFU/g））。54 h以后，納豆激酶活力逐漸降低，這可能是在衰亡期的菌株GULR06代謝出具有能夠降解納豆激酶的物質造成的。目前，國內外有關篩選產納豆激酶菌株酶活力的報道多數為100～3 000 IU/g，另外有部分較高納豆激酶活力的報道為3 000～5 000 IU/mL[22-25]。本研究所分離菌株GULR06的納豆激酶活力顯著高于大多的報道，具有良好的開發應用前景。

2.5 生物胺衍生物標準品高效液相色譜分析及精密度實驗結果

圖5 生物胺混合標準品高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of mixed standard of biogenic amines

如圖5所示，8 種生物胺衍生物標準品在25 min內能全部出峰，出峰前后順序分別為色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。其中，色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的保留時間分別為5.129、10.173、12.305、13.338、14.500、15.517、19.777、21.144 min，分離度都大于1，由此可見各種生物胺衍生物標準品能有效分離。

圖6 納豆樣品中生物胺的高效液相色譜圖Fig.6 Chromatogram of biogenic amines in natto sample

由圖6可知，納豆樣品中生物胺在液相色譜上分離效果較好，可由生物胺混合標準品圖譜的保留時間來確定樣品的生物胺。

表3 高效液相色譜法測定生物胺的特征指標及其精密度實驗結果Table3 Calibration equations, correlation efcient and precision(relative standard deviation) for biogenic amines

表3 高效液相色譜法測定生物胺的特征指標及其精密度實驗結果Table3 Calibration equations, correlation efcient and precision(relative standard deviation) for biogenic amines

生物胺標準品 回歸方程 相關系數（R2） 相對標準偏差/%色胺 y=18.051x-15.468 0.999 78 0.89 2-苯乙胺 y=20.971x-1.246 0.999 88 0.21腐胺 y=27.778x-7.373 6 0.999 80 0.47尸胺 y=43.326x+20.636 0.995 09 1.03組胺 y=38.565x-51.726 0.994 43 2.58酪胺 y=40.162x-58.508 0.995 47 3.26亞精胺 y=49.351x-1.9144 0.999 92 0.65精胺 y=62.635x-8.0793 0.999 98 0.56

由表3可見，8 種生物胺標準品的回歸方程相關系數R2均大于0.994 0，說明標準曲線呈良好的線性關系，能滿足檢測樣品中生物胺的要求。對質量濃度為80 mg/L的生物胺混合標準品，連續進樣6 次，8 種生物胺的相對標準偏差范圍為0.21%～3.26%，均小于4%，說明該液相色譜具有良好的精密度，方法重復性也較好。

2.6 納豆發酵過程中生物胺的含量變化

表4 納豆發酵中生物胺含量Table4 The contents of biogenic amines in natto products

納豆發酵過程中的生物胺含量見表4，從不同發酵時間的納豆樣品中共檢測出8 種生物胺，只有尸胺、2-苯乙胺、精胺和酪胺在部分發酵時間中未能檢測出。在發酵過程中不同生物胺的產量均有差異，其中色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺和生物胺總量在納豆發酵過程中的含量范圍分別為12.51～30.06、ND～10.56、2.34～4.63、ND～1.02、1.52～1.80、ND～16.53、6.64～11.61、ND～4.42、26.47～72.97 mg/kg。從表4可以看出，除了色胺、2-苯乙胺、酪胺和亞精胺的生物胺含量上升外，其他的生物胺含量都保持不變或緩慢的下降，但生物胺總量由于色胺和酪胺較大幅度升高而上升。有報道指出，酪胺和尸胺能夠抑制腸道中組胺-N-甲基轉移酶和二胺氧化酶的活性，從而增強組胺對機體的毒性[26]。同時尸胺和腐胺可以同亞硝酸鹽發生反應生成致癌物質亞硝胺，并能黏附一些腸黏膜上的腸道致病菌對機體構成危害[27-28]。另外，由于發酵食品中生物胺的形成不僅與原料選擇和加工條件相關，同時也跟發酵過程中的微生物聯系緊密，因此生物胺含量的高低也可被視為發酵過程中微生物污染的重要指標。

在整個納豆發酵過程中，生物胺總量的變化趨勢是隨著時間推移而緩慢的增加。其中，在發酵0～12 h過程中生物胺總量有一定的下降，造成這種現象的原因可能是由于該時段為納豆發酵時的延滯期，菌株GULR06在適應固態發酵環境，菌株緩慢開始生長，生物胺的代謝也剛開始進行，導致總生物胺的產生量低于總生物胺的揮發量，因而在此階段生物胺的總量緩慢下降。在12～72 h的生物胺總量總體呈上升趨勢，只有42～48 h中有一定的下降，這是由于該階段為菌株的衰亡期，菌株大量死亡或生長畸形，生理代謝活動趨于停滯，而生物胺緩慢揮發導致此階段生物胺總量下降。有研究表明，人體攝入生物胺總量超過1 000 mg/kg時會嚴重危害健康[29]。而由圖7可以看出，本實驗采用的枯草芽孢桿菌GULR06純種進行納豆發酵的各時段生物胺總量均小于80 mg/kg，遠低于報道的危害人體健康的生物胺總量。有調查顯示[30]，25%的日本人每天食用100～200 g納豆，以納豆樣品中檢測的生物胺總量進行估算，應不存在安全問題，因而具有很大的商業生產價值。結合圖4的納豆發酵中納豆激酶的合成曲線，可發現在用枯草芽孢桿菌GULR06進行納豆發酵時，納豆激酶相對活力在54 h時達到最大，為（5 439.5±149）IU/g，而在此時間生物胺總量為（56.18±4.94）mg/kg。以生產安全和納豆激酶活力的角度而言，采用枯草芽孢桿菌GULR06進行納豆生產時應在發酵到54 h時終止反應。

圖7 納豆發酵中生物胺總量變化曲線Fig.7 Changes in biogenic amines contents during natto fermentation

3 結 論

本研究采用纖溶活性篩選法從貴州織金農家土制煙熏臘肉中分離篩選出一株高產納豆激酶菌株GULR06，對菌株的菌株形態、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系統發育分析，鑒定得到該菌株為枯草芽孢桿菌。用黃豆為主要原料進行固態發酵制備納豆，通過高效液相色譜-紫外檢測方法對發酵過程中的生物胺進行檢測，得到在25 min內尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亞精胺、組胺在都能得到很好的分離，線性關系良好，R2均大于0.994 0，重復性的相對標準偏差均小于4%。在納豆發酵過程中，對人體危害較大的2-苯乙胺、酪胺、組胺的含量均沒有超過危險值，且生物胺總量范圍在26.47～72.97 mg/kg之間，遠低于人體攝入生物胺總量，所以本研究生產的納豆不存在生物胺的食用安全性問題。

同時結合研究了發酵過程中納豆激酶活力和生物量的變化。發現在發酵到54 h時，納豆激酶活力達到最高，為（5 439.5±149）IU/g，活菌數為13（lg（CFU/g）），此時生物胺總量為（56.18±4.94）mg/kg。以納豆安全性和酶活力得率的角度，得到了用枯草芽孢桿菌GULR06進行納豆生產時應在發酵到54 h時終止反應。由于本研究所制備的納豆具有高纖溶活性和安全性好的優點，因而對納豆食品的研發和食品安全的控制都有很好的指導意義。