元胡醇提物對乳腺癌模型小鼠G-CSF、TGF-β1、IL-10表達的影響

石榮珍 周桂芬 高建莉

作者單位：浙江中醫藥大學基礎醫學院（杭州 310053）

元胡又名延胡索，具有活血、理氣、止痛的作用，常用于胸脅、脘腹疼痛，經閉痛經，產后瘀阻，跌撲腫痛等。元胡中主要成分為生物堿，具有很強的鎮痛、鎮靜、降壓、抗心律失常，抗腫瘤、抗氧化、保肝等作用[1]。元胡屬于活血化瘀藥，學術界對元胡是促進腫瘤發展還是抑制腫瘤發展一直爭論不休。本課題組前期對元胡的化學成分、藥理作用及質量控制進行了研究，體外實驗研究也表明復方延胡索散（元胡、莪術）對乳腺癌細胞具有抑制作用[2-5]。但目前多數學者認為，活血藥對腫瘤的轉移作用與用藥劑量、活血化瘀強度有關，部分中藥表現為小劑量沒有明顯促進轉移的作用，中高劑量促進轉移。有研究[6]表明，單味中藥煎劑丹參、赤芍、莪術會促進小鼠Lewis肺癌血管生成，能夠促進腫瘤組織微血管密度（MVD）及血管內皮生長因子（VEGF）表達，促進腫瘤血管生成，促進轉移。為了明確元胡的體內抗腫瘤作用，在前期基礎上，本研究采用4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型，研究不同劑量元胡提取物對乳腺癌肺轉移及荷瘤機體免疫器官的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器 元胡購自浙江省中醫院，40℃干燥24h后打粗粉，稱取延胡索粉末200g，95%乙醇5倍量熱回流提取5次，每次2h，旋蒸濃縮后冷凍干燥，得到延胡索浸膏2.211g（1mg浸膏相當于生藥0.09g），浸膏得率為1.11%。DMEM（杭州吉諾生物，批號8116490），胰蛋白酶（杭州吉諾生物，批號20170723），磷酸鹽緩沖液（PBS）（Solarbio，批號11310215），胎牛血清（SIGMA，批號 14C410），牛血清白蛋白（BSA）（碧云天，批號 EZ2811C225），3，3'-DIAMINOBENZIDINE（DAB）（SIGMA，批號 SLBQ 8533V），甲醛溶液（上海振興化工一廠，批號201603132），30%過氧化氫（永華化學科技有限公司，批號20160619），改進型檸檬酸鈉抗原修復液（碧云天，批號EZ2811C225），伊紅染液（上海生工有限公司，批號D323F A0002），蘇木（上海生工有限公司，批號 D301F A0002），培養瓶、離心管（BD Falcon，批號353504）。一抗（粒細胞刺激集落因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）抗體（批號 9351）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）抗體（批號 52561）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）抗體（批號 146）、分化簇 3（cluster of differentiation 3，CD3）抗體（批號 18871）均購自美國Santa Cruz公司。小鼠/兔增強聚合物抗體（中衫金橋，批號 K176918E）。超凈臺（BJ-2CD，上海博迅實業有限公司），包埋機（YaBo 400，常州市雅博電子設備有限公司），切片機（德國萊卡，LEICA RM2245），熒光倒置顯微鏡（IX71，OLYMPUS），游標卡尺（SERIES NO.531，Mitutoyo），動物吸入式麻醉機（Ret，英國 Mss）。

1.2 細胞株與細胞培養 4T1小鼠乳腺癌細胞，由美國芝加哥大學何通川教授惠贈。采用DMEM完全培養基（含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L、鏈霉素100mg/L），在 37°C、飽和濕度及 5%CO2的細胞培養箱內培養，待細胞融合至85%時，用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化，按1:4傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 動物分組及給藥 BALB/C小鼠36只購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號碼：SCXK（滬）2013-0016，4～6周齡雌性小鼠，體質量18±2g，SPF級，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中

心，自由飲食，維持12h/12h明暗周期。分為正常組、模型組、元胡低、中、高以及環磷酰胺（cytoxan，CTX）組，每組6只。造模兩天后開始給藥，其中正常組、模型組予以等量生理鹽水灌胃每3天1次，元胡低、中、高劑量組分別予元胡醇提物0.75mg/kg、1.3mg/kg、2.6mg/kg灌胃，每3天1次，CTX組予CTX100mg/kg腹腔注射，1周1次。

1.4 BALB/c小鼠乳腺癌模型的建立 適應性喂養1周后，選取健康BALB/c小鼠36只，氣麻機2%的異氟烷麻醉，除正常組外的小鼠均于右側倒數第二對乳腺脂肪墊下接種1×107/只4T1，每只注射100μL，制備小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型。

1.5 體質量及腫瘤體積監測 開始給藥后，每5天小鼠稱重1次，并采用游標卡尺測量腫瘤瘤體長徑L（mm）和短徑 W（mm）。瘤體積 V（mm3）=（L+W）×L×W×0.2618。

1.6 臟器取材 用藥4周后處死小鼠，將剝離的肺、脾、胸腺、淋巴結、瘤體稱重后置于福爾馬林中固定后，瘤體切取中斷，胸腺、淋巴結整個用海綿包裹，常規脫水后石蠟包埋，4μm厚度切片，用于HE染色和免疫組織化學染色。

1.7 計算臟器指數、抑瘤率以及肺轉移病灶數 臟器指數（g/g）=臟器質量（g）/體質量（g）×100%；抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。肺臟用福爾馬林固定48h后，肉眼計數肺表面腫瘤轉移灶數。

1.8 HE染色方法 腫瘤、胸腺、淋巴結石蠟切片脫蠟水化，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精染色，1%鹽酸酒精中浸泡15～30s，自來水沖洗返藍，伊紅染色，中性樹膠封片。每只小鼠選取3～5張切片染色、每張染色片隨機取3～5個視野（×200），觀察各組臟器的病理表現和特點，比較乳腺癌荷瘤小鼠與正常小鼠腫瘤、胸腺、淋巴結組織形態學差異。

1.9 免疫組化染色方法 石蠟切片取病灶明顯處切片進行烘烤，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，3%H2O2孵育消除內源性過氧化物酶，滴加鼠抗 IL-10、G-CSF、TGF-β1、CD3 抗體（1:100），4℃濕盒孵育過夜后室溫復溫2h，滴加小鼠/兔增強聚合物抗體工作液37℃孵育30min，PBS緩沖液漂洗，DAB顯色，蘇木復染，顯微鏡下觀察，中性樹膠封片，晾干顯微鏡下進行觀察。每只小鼠選取3～5張切片染色，每張染色片隨機取3～5個視野（×200）。結果判定：細胞核清晰，胞質有黃色或褐色著色的細胞為陽性細胞。

1.10 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行統計處理。連續型變量用均數±標準差（±s） 表示，分別采用單因素方差分析（one-way ANOVA）、兩兩比較的Student's t-test分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 元胡醇提物對小鼠腫瘤體積的影響 CTX組與模型組比較腫瘤體積差異有統計學意義（P＜0.01）；元胡高、中、低組與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 乳腺癌小鼠腫瘤組織中G-CSF、IL-10、TGF-β、CD3陽性細胞（免疫組化染色 ×200）

2.2 元胡醇提物對乳腺癌小鼠瘤重、臟器指數的影響 正常組與模型組肺、脾、胸腺、淋巴結臟器指數相比差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，元胡中、高劑量組小鼠脾臟指數較高（P＜0.01）；元胡高劑量組小鼠肺臟指數與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）；元胡高劑量組小鼠瘤重與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；元胡各劑量組小鼠淋巴結指數與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，CTX組小鼠的瘤重、脾臟、肺臟、淋巴結指數都較低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。以模型組為對照，計算元胡低劑量組抑瘤率為2.3%，而元胡中高劑量組抑瘤率為-2.0%、-2.4%，均為負值，認為會促進腫瘤的生長。

表1 各組乳腺癌小鼠腫瘤體積比較（mm3，±s）

表1 各組乳腺癌小鼠腫瘤體積比較（mm3，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；CTX：環磷酰胺

組別模型組元胡高劑量組元胡中劑量組元胡低劑量組CTX組鼠數6 6 6 6 6第5天118.17±41.95 110.24±39.87 118.95±33.88 84.69±21.80 37.57±22.51*第10天204.26±40.73 210.39±70.01 231.38±90.20 221.82±84.57 70.12±38.04*第15天551.32±215.17 579.25±247.29 562.88±221.78 589.15±216.04 141.46±116.31*第20天973.05±215.17 993.59±247.29 975.13±221.78 961.58±216.04 222.69±116.31*第25天1768.61±343.96 1860.66±583.00 1764.52±512.54 1732.88±402.52 407.51±132.61*

2.3 元胡提醇物對乳腺癌小鼠肺轉移的影響 模型組小鼠肺轉移病灶塊與正常組相比差異有統計學意義（P＜0.01），CTX組與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01），元胡中、高劑量組與模型組相比無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

表2 各組小鼠臟器指數及瘤重比較（%，±s）

表2 各組小鼠臟器指數及瘤重比較（%，±s）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01；CTX：環磷酰胺

組別正常組模型組元胡低劑量組元胡中劑量組元胡高劑量組CTX組鼠數6 6 6 6 6 6肺臟0.70±0.03 1.49±0.05△1.25±0.04*1.35±0.02*1.56±0.04 0.82±0.02*脾臟0.52±0.02 6.69±0.16△6.95±0.14 7.22±0.19*7.29±0.14*1.51±0.04*胸腺0.22±0.01 0.17±0.02△0.28±0.03*0.30±0.02*0.32±0.02*0.15±0.01*瘤重（g）0±0 5.06±0.09△4.93±0.14 5.24±0.11 5.47±0.15*1.58±0.07*淋巴結0.02±0.00 0.15±0.01△0.20±0.01*0.29±0.01*0.34±0.03*0.03±0.002*

表3 各組小鼠肺轉移病灶數比較（個，±s）

表3 各組小鼠肺轉移病灶數比較（個，±s）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01；CTX：環磷酰胺

組別正常組模型組元胡低劑量組元胡中劑量組元胡高劑量組CTX組鼠數6 6 6 6 6 6總數0 11.83±8.70△8.67±5.29 16.33±8.96 14.0±4.86 0*＞2mm 0 3.33±2.94△3.33±2.34 6.67±4.46 4.67±1.97 0*＜2mm 0 8.50±5.89△5.33±2.07 9.67±8.71 9.0±5.37 0*

2.4 元胡醇提物對乳腺癌小鼠瘤體、胸腺、淋巴結組織形態學影響 小鼠腫瘤、胸腺、淋巴結組織病理結果顯示，模型組、元胡高劑量組細胞大小、形態不一，排列紊亂，失去極性；細胞核畸形，呈分葉狀、結節狀、不規則形；染色質明顯增多、增粗。CTX組與模型組相比細胞排列較整齊且疏松。元胡低、中劑量組細胞較模型組形態規則，排列較整齊。胸腺為機體重要的淋巴器官，與機體免疫系統密切相關。正常小鼠胸腺中央染色較淺，周圍由密集的小淋巴細胞構成，染色深暗。模型組和元胡高劑量組小鼠胸腺組織結構紊亂，未見明顯的暗區與明區分別。而元胡中、低劑量組小鼠胸腺細胞結構明顯較模型組規則，有明顯的明區暗區之分，可見密集的小淋巴細胞團。

2.5 元胡醇提物對腫瘤組織IL-10、TGF-β1、G-CSF和胸腺組織CD3表達的影響 腫瘤組織IL-10、TGF-β1、G-CSF表達陽性。與正常組相比，模型組IL-10、TGF-β1、G-CSF 陽性表達增高。CTX 組 IL-10、TGF-β1、G-CSF 陽性表達率較模型組降低，而元胡各劑量組IL-10、TGF-β1、G-CSF組陽性細胞數較模型組多，且呈濃度和劑量依賴性。胸腺組織中淋巴細胞表達為CD3陽性。模型組CD3陽性表達率比正常組增高。CTX組CD3陽性細胞表達較模型組減少。元胡中高組陽性細胞表達率較模型組增多。見圖1（封二）。

3 討論

活血化瘀藥在抗腫瘤領域的應用一直存在諸多爭議，僅破血藥對腫瘤的抑制作用得到較廣泛的公認[7]。有研究[8]表明，血府逐瘀湯、桂枝茯苓丸等活血化瘀方劑對移植瘤的生長、轉移及腫瘤血管生成無明顯影響。元胡為活血止痛藥，是臨床止癌痛的重要中藥。多項細胞水平的研究表明，元胡中的小檗堿、元胡多糖等均具有抗腫瘤細胞增殖作用[2-4]；小檗堿和延胡索乙素聯用時，具有抗腫瘤增殖作用[5-6]；延胡索和莪術也有協同抗腫瘤增殖的作用[9]。本研究顯示，元胡中、低劑量組有促進腫瘤生長的趨勢，元胡高劑量組顯著增加瘤重（P＜0.01）。

乳腺癌是女性高發的惡性腫瘤之一，在乳腺癌的發生發展中，不同種T細胞發揮了不同的調控作用。其中細胞毒T 細胞（cytotoxic Tcell，TC）又稱為殺手T細胞，可以對產生特殊抗原反應的目標細胞進行殺滅。輔助T細胞（helper Tcell，Th）在免疫反應中扮演中間過程的角色，主要是調控或“輔助”其它淋巴細胞發揮功能。調節性T細胞（regulatory cells，Tregs）也發揮著重要作用，它與自身免疫性疾病的發生密切相關，在腫瘤的生存和轉移中起著至關重要的作用。Treg可以通過與細胞表面表達的抑制性分子及其分泌的細胞相互作用而發揮抑制T細胞抗腫瘤免疫的功能[10]。在Treg中1型調節性T細胞（type cells，Tr1）分泌 IL-10；Th3 細胞分泌 TGF-β；研究表明，長期監測IL-10、TGF-β水平，可以為乳腺癌的評估和治療提供依據[11]；IL-10還可以通過抑制抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）的活化作用產生對T細胞的抑制效應來形成免疫抑制環境，從而誘導腫瘤免疫逃逸[12]。研究[13]表明，在腫瘤中晚期，腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associatedfibroblasts，CAFs）所分泌的TGF-β過多，可以促進腫瘤組織的轉移。這與腫瘤微環境中細胞能通過直接或間接作用負向調節其他免疫細胞，抑制抗腫瘤的免疫反應機制有密切關系。在腫瘤免疫調控中，B細胞分泌的IL-10和TGF-β也發揮負向免疫調控作用而且能夠通過產生病理性抗體參與腫瘤轉移前微環境的形成，誘導腫瘤轉移[14]。IL-10可以通過負向免疫調控肺癌小鼠的生長[15]。TGF-β1也可以通過增加上皮細胞間充質轉化（epithelial to mesenchymal，EMT）相關Snail蛋白、纖維連接蛋白（fibronectin）、抗衰蛋白、基質金屬蛋白酶-2蛋白（matrix metalloprotein-2，MMP-2）、Rho家族三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）類蛋白RhoA的表達和活化細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT/PKB）信號通路而促進乳腺癌細胞轉移[16-17]。

G-CSF作為一種造血生長因子，能夠促進中性粒細胞的分化和成熟，通常用于治療癌癥化療后的嗜中性粒細胞減少癥。近年研究[18]表明，G-CSF在子宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達高于癌旁組織，且患者外周血中G-CSF含量較高。研究[19]表明，G-CSF能夠也促進頭頸鱗癌細胞系的增殖和遷移。文獻[20-22]報道，乳腺癌腫瘤組織產生高水平GCSF與患者不良預后相關，提示G-CSF可能促進癌癥的發生和發展。

CD3為成熟的T細胞，主要存在于胸腺中，發揮免疫調節功能，與T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）相連，參與T細胞的信號轉導，主要用于標記胸腺細胞、T淋巴細胞及T細胞淋巴瘤。CD3細胞表達 IL-2R，并產生 IL-2、IL-4、IL-α、IL-β 和 IL-γ 等多種誘導細胞因子，增強T細胞、LAK細胞和NK細胞殺傷腫瘤作用[23]。

本研究顯示，元胡中高劑量組促進乳腺癌荷瘤小鼠免疫器官的臟器指數（P＜0.01），上調G-CSF、TGF-β1、IL-10等腫瘤相關炎癥因子的表達和CD3陽性細胞的數量，促進腫瘤增殖和轉移，表現與腫瘤免疫治療出現的細胞因子風暴類似。細胞因子在免疫反應中發揮著巨大作用，但細胞因子風暴卻是免疫細胞及細胞因子過量產生的現象，是腫瘤細胞免疫治療中最主要的一個不良反應。由于腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1、IL-6、IL-12、干擾素-α（IFN-α）、IFN-β、IFN-γ、人單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和IL-8等細胞因子，大量釋放，引起機體出現呼吸衰竭和多器官衰竭等，會顯著提高患者死亡率。元胡中高劑量顯著促進荷瘤機體免疫反應，同時增加乳腺癌的增殖和轉移，有鑒于此，在元胡止癌痛的臨床應用中，應注意用藥劑量或配伍使用。元胡在乳腺癌轉移中作用的具體機制尚有待進一步探索。