益腎安宮方對復發性自然流產患者外周血Th17/Treg細胞及相關細胞因子表達水平的影響*

張 偉 王晨曄 丁彩飛 孫 忻

浙江省杭州市紅十字會醫院 浙江 杭州 310003

復發性自然流產(RSA)病因復雜，近年來的研究表明，免疫因素，特別是與免疫調節相關的細胞因子以及調節細胞在RSA的發病機制中起到重要的作用[1-2]。本科以益腎安宮方治療RSA患者，取效滿意，觀察其對RSA患者外周血Th17/Tr eg細胞、白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達水平的影響，從細胞及分子水平初步闡明作用機制。報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇：分述如下。

1.1.1 RSA病例組：選擇2016年7月至2017年12月于杭州市紅十字會醫院生殖醫學科就診的RSA患者60例（妊娠12周內，有RSA病史），簽署知情同意書后，隨機將其分為治療組與對照組，每組30例。治療組平均年齡31.60±5.06歲，平均自然流產次數2.40±0.67次；對照組平均年齡31.83±5.56歲，平均自然流產次數2.47±0.68次。

1.1.2 正常組：選擇同期于本院就診的正常早孕期女性30例（妊娠12周內，無自然流產病史）。平均年齡29.87±3.93歲。

1.2 診斷標準：西醫診斷標準參照《婦產科學》（全國高等醫藥院校教材第7版）的相關內容制定。中醫診斷標準參考《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語證候部分》《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002年版)及《中醫婦科學》（新世紀全國高等中醫藥院校規劃教材第2版）的相關內容制訂。

1.3 治療方案：對照組結合患者血孕酮水平給予黃體酮針20～40mg，1日1次，肌肉注射保胎治療。治療組在此基礎上配合中醫辨證施治，分為腎虛血熱型和脾腎兩虛型，前者給予益腎安宮Ⅰ號方（保陰煎加減：生地、熟地、炒白芍、山藥、炒川斷、黃芩、桑寄生各15g，阿膠珠、旱蓮草各12g，甘草5g）；后者給予益腎安宮Ⅱ號方［壽胎丸合四君子湯加減：炒黨參、炒川斷、桑寄生、杜仲、炒白芍、熟地各15g，菟絲子30g，炒白術、茯苓、阿膠珠（烊兌）各12g，甘草5g］。每日1劑。水煎服，早晚分服。7天為1個療程。連續服用至孕12周。

1.4 標本采集：RSA治療組及對照組分別于治療前、治療后（孕12周時）抽取靜脈血，正常組于首次就診時抽取。所有研究對象均于清晨采集空腹靜脈血5ml，其中3ml全血加入肝素鈉抗凝管，應用Ficol l淋巴細胞分離液分離外周血單個核淋巴細胞(PBMC)；另2ml全血不抗凝，在小試管中自然凝血后收集血清，-70℃保存待用。

1.5 檢測方法：采用流式細胞儀測定各樣本中Th17和Tr eg細胞比例，具體操作方法按照試劑盒說明規范進行；并嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行規范操作，測定IL-6、IL-17、TGF-β1血清樣本的吸光度值，繪制標準曲線，計算其濃度值。

1.6 臨床療效評定標準：參照第7版《婦產科學》及《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002年版)的相關內容修改制定：①治愈：妊娠超過2O周，孕20周時B超檢查示胎兒發育正常，與孕周相符，伴隨的臨床癥狀和體征消失或明顯改善；②好轉：妊娠超過以往流產最長孕周，但未超過20周，于以往流產孕周進行B超檢查示胚胎(胎兒)發育正常，與孕周相符，伴隨的臨床癥狀和體征有所改善；③未愈：妊娠未超過以往流產最長孕周即發生流產，伴隨的臨床癥狀和體征無改善或有加重。B超檢查示子宮大小與孕周基本相符或小于孕周，胚胎發育不良或停止發育。

2 結果

2.1 兩組臨床療效比較：見表1。

表1 兩組臨床療效比較

2.2 各組外周血Th17細胞與Tr eg細胞百分率、Th17/Tr eg比值比較：見表2。

表2 各組外周血Th17細胞與Tr eg細胞百分率、Th17/Tr eg比值比較（）

表2 各組外周血Th17細胞與Tr eg細胞百分率、Th17/Tr eg比值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對照組治療后比較，#P＜0.05；與本組治療前比較，△P＜0.05。

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2.3 各組外周血細胞因子水平比較：見表3。

表3 各組外周血IL-6、IL-17及TGF-β1水平比較（）

表3 各組外周血IL-6、IL-17及TGF-β1水平比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對照組治療后比較，#P＜0.05；與本組治療前比較，△P＜0.05。

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3 討論

復發性自然流產屬中醫學“滑胎”范疇，亦稱“數墮胎”“屢孕屢墮”等。滑胎病機主要為母體沖任損傷，胎元不健。胎兒居于母體，全賴母體腎以系之，氣以載之，血以養之，沖任以固之。若母體腎氣健壯，氣血充實，沖任通盛，則胎固母安；反之則滑胎。胎元不健，多由父母先天之精氣虧虛，兩精雖能結合，然先天稟賦不足，致使胚胎損傷或不能成形，或成形易損，故而屢孕屢墮。病性以虛為主，或為虛實夾雜之證。對滑胎者，治療當“預培其損”，孕前宜以補腎健脾，益氣養血，調理沖任為主；孕后即應積極進行保胎治療。益腎安宮Ⅰ號方及益腎安宮Ⅱ號方分別化裁自中醫經典名方保陰煎、壽胎丸合四君子湯。前者方中炒川斷、寄生補腎固沖，熟地黃、阿膠珠補血養陰，黃芩清熱安胎，生地清熱涼血，旱蓮草滋補肝腎，山藥健脾養胃，白芍養血斂陰，甘草調和諸藥，全方共奏益腎養陰、清熱涼血、固沖安胎之功。后者方中杜仲、炒川斷、寄生、菟絲子補腎益精，炒黨參、炒白術、茯苓健脾益氣，熟地、阿膠珠補血養陰，炒白芍養血斂陰，甘草調和諸藥，全方共奏補腎健脾、益氣養血、固沖安胎之效。

近年來隨著免疫學領域的迅速拓展，發現RSA的發生與免疫因素密切相關。研究發現，Th17/Treg細胞在妊娠過程中發揮著不可忽視的作用，并且可以解釋更多關于妊娠失敗的病理機制。本研究結果表明：RSA治療組與RSA對照組外周血中Th17細胞比例均高于正常組，而兩組Tr eg細胞比例均低于正常組，兩組Th17/Tr eg比值均高于正常組，提示RSA患者外周血中Th17細胞比例高于健康孕婦，Tr eg細胞比例低于健康孕婦，存在Th17/Tr eg平衡失調。Th17細胞產生的最重要的效應因子是IL-17，IL-17可與靶細胞表面IL-17受體（IL-17R）結合，具有動員和富集中性粒細胞及促炎作用，可有效介導病變組織的炎性反應[3]。IL-6和TGF-β1是Th細胞分化的關鍵調節因子，與Th17細胞和Tr eg細胞的分化密切相關。本研究結果表明，RSA治療組與RSA對照組外周血IL-6、IL-17水平均高于正常組，而TGF-β1水平均低于正常組，提示RSA患者外周血IL-6、IL-17水平高于健康孕婦，而TGF-β1水平卻低于健康孕婦。聯合使用益腎安宮方治療后，RSA患者外周血中Th17細胞比例下降至接近健康孕婦水平，Tr eg細胞比例上升至接近健康孕婦水平，RSA患者外周血Th17/Treg比值下降，Th17/Tr eg失衡現象得以改善，Th17/Tr eg平衡向Treg方向偏倚，有利于妊娠的維持。RSA患者外周血IL-6、IL-17水平下降至接近健康孕婦水平，TGF-β1水平上升至接近健康孕婦水平，推測益腎安宮方通過降低RSA患者外周血IL-6、IL-17水平，升高其TGF-β1水平，促使部分初始CD4+T細胞不斷分化成Tr eg細胞，抑制Th17細胞的產生，使Th17/Tr eg比值維持在正常妊娠狀態，最終有利于妊娠的結局。