益腎蠲痹丸對CIA大鼠輔助性T細胞相關細胞因子的影響?

展俊平，孟慶良，范 圍，屈祥科，陳夢雪，王建明Δ

(1.河南中醫藥大學第二附屬醫院風濕病科，鄭州 450002； 2. 中日友好醫院中醫風濕科，北京 100029)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關節慢性炎癥、非化膿性炎癥等為主要表現的多系統、炎癥性自身免疫性疾病[1]。現代醫學研究證實，類風濕關節炎急性期以間質水腫和中性粒細胞浸潤為主；慢性期滑膜下層出現結節，內含大量浸潤的CD4+T淋巴細胞，又稱輔助性T細胞(Th細胞)。Th細胞是細胞因子的主要來源，根據其分泌的細胞因子種類不同，可分為Th0、Th1、Th2及Th17等多種亞型，其中包括Th1細胞多分泌IFN-γ、IL-2等，Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，Th17細胞分泌IL-17。這些細胞因子相互聯系構成“分子網絡”，共同調節機體“免疫-神經-內分泌”的平衡，對RA的發生發展起關鍵調控作用。

“益腎蠲痹丸”是根據著名中醫風濕病專家朱良春先生臨床經驗方開發的中成藥。實驗研究表明，該藥對改善RA患者臨床癥狀、預防關節骨膜破壞有肯定療效，其相關藥理機制的研究有待深入開展[2-3]。本實驗以Th細胞相關細胞因子為切入點，以膠原誘導的類風濕關節炎大鼠模型(collagen induced arthritis, CIA)為實驗材料，定量分析益腎蠲痹丸對Th細胞相關細胞因子的影響，為探究益腎蠲痹丸的藥理機制提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑及耗材 益腎蠲痹丸，江蘇正大清江藥業有限公司提供(Z10890004)；弗氏不完全佐劑及牛II型膠原，購自Sigma-Aldrich公司 (MO, USA)；ProcartaPlexTM多因子免疫檢測試劑盒購自萊茲生物(ebioscience，貨號EPX060-20831-901)。IL-17酶聯免疫試劑盒購自Bender 公司(USA)；常規實驗室化學試劑購自北京化學試劑有限公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠60只(雌雄各半，7～8周齡)，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心(動物合格證號SCXK(京)2005-0004)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠CIA模型制備 采用2次免疫法制備CIA大鼠模型。制備方法：在尾根部注射牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑乳化液200μg(1 mg/ml)，7 d后依照相同方法行第2次注射牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑乳化液100 μg[4]。對照組大鼠用相同方法注射生理鹽水。

1.2.2 大鼠CIA模型評估 采用關節腫脹度測量方法。造模前在大鼠后肢踝關節上方0.5 cm處做出標記，用足趾容積測量儀測量其容積，計算其關節腫脹度。計算公式：腫脹度(edema rate)=(Vt-V0)/V0×100%(其中V0表示造模前的容積，Vt表示造模后的容積)。

1.2.3 動物分組及給藥 首次免疫后18 d，依據關節腫脹度篩選出CIA模型復制成功的大鼠30只，按隨機數字表法分成模型組(溶劑對照)、陽性藥治療組(甲氨喋呤，2.0 mg/kg.每周1次)和益腎蠲痹丸治療組(4 g/kg·d)，每日1次，連續4周,正常對照組灌以等容積純水。治療結束后，各組大鼠經戊巴比妥鈉麻醉，采用腹主動脈取血，2500 r/min，20 min離心后取血清分裝后，-80℃冰凍備用。

表1 各組大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 A及IFN-γ水平檢測結果

注： CIA模型組與正常對照組比較：**P<0.01；治療組與CIA模型組比較:#P<0.05,##P<0.05

1.2.4 ProcartaPlexTM多因子免疫法檢測血清細胞因子水平 依照試劑盒說明書的流程操作(該試劑盒包含IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 A的抗體磁珠)。取平底96孔板，加入上述抗體磁珠混合物；手持式磁性洗板器清洗磁珠，棄清洗液后加入25 μL標準品和待測樣品，室溫避光孵育2 h，手持式磁性洗板器洗培養板2次，每次30 min；加檢測抗體混合物振蕩孵育30 min；洗板后加鏈霉親和素-PE(SAPE)振蕩孵育30 min；洗板后上機檢測(Luminex儀器讀板)。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析t檢驗，P<0.05，P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 關節腫脹度測量結果

圖1顯示，為對比藥物療效于治療結束后測定各組大鼠關節腫脹度，結果表明與正常對照組比較，CIA大鼠關節腫脹度顯著增高(P<0.01)；與CIA模型組比較，甲氨喋呤及益腎蠲痹丸治療組大鼠關節腫脹度均有顯著降低趨勢(P<0.05)，且組間比較差異無統計學意義。

圖1 治療結束后各組大鼠關節腫脹度檢測結果(n=10)注： CIA模型組與正常對照組比較：**P<0.01；治療組與CIA模型組比較：#P<0.05

2.2 血清細胞因子水平檢測結果

表1顯示，多細胞因子檢測結果表明，與正常組比較CIA大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10及IL-17 A水平均呈顯著增高趨勢(P<0.01)，而IL-4及IFN-γ水平呈顯著下降趨勢(P<0.01)。與CIA模型組比較，益腎蠲痹丸治療組大鼠血清IL-2、IL-6及IL-17 A水平呈顯著降低趨勢(P<0.05)，IL-10水平呈顯著升高趨勢(P<0.05)；而IL-4及IFN-γ水平變化不顯著，組間比較差異無統計學意義。此外，益腎蠲痹丸治療組與甲氨喋呤治療組間比較，上述細胞因子水平變化比較差異無統計學意義。該結果初步表明，益腎蠲痹丸能下調CIA大鼠機體IL-2、IL-6、IL-17 A的表達，同時上調IL-10表達。

3 討論

RA的病理特征主要是關節滑膜炎癥，伴隨滑膜細胞和血管異常增生，淋巴細胞、中性粒細胞及單核細胞向關節軟骨及周圍組織浸潤，其關節病變呈慢性進行性、持續和反復發作的特點且致殘率高[5-6]。近年來，由于慢作用抗風濕藥的早期聯合使用，以及生物制劑、激素、免疫抑制劑、生物制劑等新型藥物不斷出現，使RA的預后有了明顯改善，多數RA患者的病情可得到理想的控制甚至完全緩解[7-8]。盡管如此，西醫臨床常用治療方案尚存在很多不足，如明顯副作用、耐藥、價格昂貴等。為此，尋找并開發抗RA有效的天然藥物成為研究者共同關注的命題。

RA屬于中醫痹癥范疇，其病機與肝、腎虧虛及慢性勞損有關。益腎蠲痹丸的配方包含20余種中藥材，具有標本兼顧、攻補并施、益腎壯督、蠲痹通絡等功效，對改善類風濕關節炎患者臨床癥狀、控制病情發展有顯著的臨床療效。筆者所在課題組曾運用代謝組學技術探究益腎蠲痹丸干預性激素低下型CIA的作用機制。實驗結果表明，益腎蠲痹丸可以顯著抑制CIA大鼠前炎性因子(IL-1β、IL-6和IL-8)的水平[9]。本實驗依托前期研究基礎，重點觀察了益腎蠲痹丸對Th細胞相關細胞因子的影響，期望探明該藥抗炎及免疫調節的初步機制。結果表明益腎蠲痹丸能抑制機體促炎因子(IL-2、IL-6、IL-17 A)的合成和分泌，同時上調抗炎因子IL-10的表達。該結果提示，益腎蠲痹丸可在一定程度上平衡促炎細胞因子及抗炎細胞因子的平衡，其作用靶點可能與IL-2、IL-6、IL-17 A及IL-10有關，相應的基礎研究有待進一步的開展。

細胞因子(Cytokine)是指一類由活化的免疫細胞和相關細胞產生的調節細胞功能的高活性、多功能、低分子蛋白質，它是除免疫球蛋白和補體以外的另一類可溶性免疫分子，多數由淋巴細胞和單核細胞分泌[10]。其中IL-2是活化的Th1細胞分泌的細胞因子，生物學功能很復雜，過量的IL-2可引起局部慢性炎癥和基質破壞[11]。RA患者血清IL-2水平差異較大，多數學者認為其與不同病理時期、分型有關[12]。IL-6是一類多效應前炎性因子，在多種炎癥性疾病中呈高表達，其生物活性包括介導炎癥反應、參與免疫調節等[13]。IL-17是新發現的一類前炎性因子，主要由Th17細胞分泌，與機體多種炎性疾病有關。其不僅對組織炎癥具有明顯的促進作用，而且介導一系列炎癥反應，直接參與RA關節軟骨及骨膜組織破壞[14]。IL-10來源較復雜，Th2細胞及Treg細胞均可分泌。IL-10不僅能抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等前炎性因子的活性，而且可抑制Th1細胞及樹突狀細胞的增殖[15]。基于上述共識，益腎蠲痹丸治療RA的藥理機制可能與調節Th1、Th2、Th17等Th細胞亞型的生物學功能相關。

目前，細胞因子在RA發病中的作用已有大量的研究報道，但細胞因子之間的相互作用模式及生物學意義遠未闡明，藥物對細胞因子影響的作用途徑及機制尚不清楚[16]。本實驗尚局限于對益腎蠲痹丸影響Th相關細胞因子的現象觀察，進一步的分子機制研究正在開展中，不久的將來我們將持續報道益腎蠲痹丸治療RA分子藥理機制的研究結果。