活血生肌湯聯合干細胞移植干預糖尿病足作用的臨床研究?

李高申，郭梅珍，牛美蘭，何雄文

(1. 黃河科技學院醫學院，鄭州 450063； 2. 河南省中醫藥研究院附屬醫院，鄭州 450006)

糖尿病患者發生糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcers，DFUs)的概率一生中高達25%，這些患者中有14%～24%的人群最終需要接受截肢治療[1]。目前糖尿病足的治療有溶栓、抗凝、擴血管、介入、血管搭橋、清創、截肢手術等，其治療療程較長、費用高且療效不理想，因此臨床急需尋求一種全新的治療方法或手段。近年來，干細胞移植治療下肢缺血病得到臨床認可。干細胞可以在體內分化為血管內皮細胞和平滑肌細胞，分泌促血管生成因子，逐漸分化并形成新生毛細血管，改善和恢復缺血下肢血流，達到治療下肢缺血的目的[2]。

本研究應用自體骨髓血干細胞移植法治療糖尿病足潰瘍，觀察和評估干細胞移植后患者的肢體下肢血流圖及疼痛、皮膚溫度、靜息痛、跛行距離、踝肱指數和潰瘍愈合率的改善情況，并觀察聯合應用活血生肌湯對糖尿病足相關指標的變化，探索糖尿病足治療的有效方法和途徑。

1 資料

1.1 一般資料

表1顯示，選取2015年1月至2016年10月河南省中醫藥研究院附屬醫院內分泌科收治糖尿病足潰瘍患者60例，在獲得醫院倫理委員會批準后(QXCRF2015-011)，每位受試者簽署知情同意書后實施。按照治療方式的不同分為常規內科治療組(簡稱常規治療治)、常規內科治療組+干細胞移植(簡稱干細胞移植組)、干細胞移植+常規內科治療+活血生肌湯聯合治療組(簡稱活血生肌湯組)3組。3組受試者基礎指標比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 各組患者基礎資料比較(±s，mmol/L)

表1 各組患者基礎資料比較(±s，mmol/L)

組別例數男/女年齡/歲病程/年糖化血紅蛋白(%)空腹血糖餐后2 h血糖P值常規治療組207∶862.20±4.575.86±2.998.15±1.408.19±1.0013.20±3.76>0.05干細胞移植組208∶763.71±5.446.07±2.418.22±1.197.34±2.5213.35±2.76>0.05活血生肌湯組208∶763.61±5.426.11±1.238.19±1.007.35±2.5313.29±2.76>0.05

1.2 診斷標準

糖尿病西醫診斷標準參照《糖尿病肢體動脈閉塞癥診斷及療效標準》(草案)[3]，中醫診斷標準參照2007年中華中醫藥學會發布的《糖尿病中醫防治指南》[4]。

1.3 納入和排除標準

納入標準：符合糖尿病足的診斷標準，參照《糖尿病肢體動脈閉塞癥診斷及療效標準》(草案)；中醫辨證為“氣陰兩虛，瘀血阻絡”病證；下肢動脈血管造影(CT angiography，CTA)檢查有肢體動脈狹窄閉塞性改變，以腘及腘動脈以遠動脈病變為最多見；年齡50～75歲；踝肱指數(ABI)≤0.4；潰瘍面積介于5～15 cm2。

排除標準：非2型糖尿病患者；50歲<年齡<75歲；不以膝下動脈病變為主的糖尿病足患者；踝肱指數(ABI)>0.4；對方案中使用的藥物過敏者；合并嚴重心、肝、腎功能不全者；排除急性下肢動脈栓塞、多發性大動脈炎、血栓閉塞性脈管炎、雷諾氏病等其他缺血性疾病。

1.4 實驗所需藥物與器材

活血生肌湯組成：紅花8 g，丹參13 g，生黃芪8 g，乳香25 g，黨參17 g，川芎10 g，赤芍18 g，大黃8 g，黃柏5 g，生地黃8 g，由河南省中醫藥研究院附屬醫院中藥制劑室制備(高壓濃縮煎煮為200 ml藥液)，分裝2袋，每袋100 ml；肝素、利多卡因、精蛋白生物合成人胰島素注射液等由醫院藥房提供。COM.TEC血細胞分離機(費森尤斯集團)；FACSCalibur流式細胞儀(上海碧迪醫療器械有限公司)；精密分析天平(上海第二天平儀器廠)；紅外線皮溫儀(意大利TECNIMED公司)；骨髓穿刺包(河南省中醫藥研究院附屬醫院)；多普勒血流探測儀及踝肱指數檢查套件(日本株式會社Hadeco公司)；C02恒溫孵育箱(德國Heracus公司)；BX41系統顯微鏡及照相系統(日本Olympus公司)；C1501DAB染色試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；超薄切片機(瑞士IMINA公司)；所有試劑(10%甲醛溶液、蘇木素、伊紅、25%戊二醛溶液、無水乙醇等)由河南省中醫藥研究院病理室提供。

2 方法

2.1 自體骨髓干細胞提取方法

依據常規術前準備所需藥品、物品，手術中嚴格按照自體骨髓干細胞的分離、處理操作要求進行。

2.2 分組與治療實施

將60例糖尿病足伴有下肢慢性缺血的患者按隨機數字表法分為常規內科治療組(常規治療組)20例共26條患肢，常規內科治療組+干細胞移植(干細胞移植組)20例共29條患肢，干細胞移植+常規內科治療+活血生肌湯聯合治療組(活血生肌湯組)20例共28條患肢，常規治療組患者從入院至隨訪結束統一行內科常規治療：統一正規胰島素制劑調血糖、氨氯地平膠囊降壓、羅伐他丁降血脂、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗感染、阿司匹林抗凝等藥物治療，潰瘍局部行外科徹底清創換藥，局部壞死組織行手術切除；干細胞移植組患者在行同常規治療組內科治療的同時，對于CTA檢查血管閉塞者行自體骨髓血干細胞移植治療；活血生肌湯組患者在常規內科治療+自體的骨髓血干細胞移植的同時口服活血生肌湯100 ml/次，每日2次(10Am，8 pm)，2周為1個療程，連用3個療程。

2.3 療效評價指標

2.3.1 主觀指標 表2顯示，疼痛、冷感采用評分表法將其量化。

表2 糖尿病足臨床癥狀量化評分標準

2.3.2 潰瘍愈合情況 觀察潰瘍面積、潰瘍面愈合及潰瘍面愈合率比較 治療3個月后，觀察患者血壓、血糖、血脂、足趾皮溫、跛行距離、踝肱指數(ABI)的變化情況，查間歇跛行患者無痛步行時間(min)、下肢動脈造影、實驗室指標檢測、病理學檢測等。

2.4 效果評價

痊愈：創面完全愈合，臨床癥狀消失；顯效：肉芽上皮生長，創面面積縮小75%，臨床癥狀有改善；好轉：肉芽上皮生長，創面面積縮小25%，臨床癥狀稍有改善；無效：肉芽上皮無明顯生長或肉芽晦暗，創面面積縮小不足25%，臨床癥狀無改善。愈合率=完全愈合例數/總例數×100%。

2.5 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，用L-SD，S-N-K進行檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 3組治療3個月后療效比較

表3顯示，與常規治療組比較，干細胞移植組和活血生肌湯組患者移植后的指標(血糖、靜息疼、足冷感覺、間歇跛行、足趾皮溫、踝肱指數)差異有統計學意義(P<0.05)；與干細胞移植組比較，活血生肌湯組患足間歇性跛行、足趾皮溫、踝肱指數評分差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 糖尿病足患者治療3個月后各項指標結果比較(±s, mmol/L)

表3 糖尿病足患者治療3個月后各項指標結果比較(±s, mmol/L)

組別例數 糖化血紅蛋白(%)空腹血糖餐后2 h血糖靜息疼足冷感覺間歇間跛行足趾皮溫踝肱指數P值常規治療組207.42±1.616.95±1.6411.23±2.242.43±0.822.99±0.452.99±0.8531.88±1.190.41±0.24干細胞移植組 207.38±1.236.86±2.1210.10±1.281.38±0.73★ 2.22±0.79★2.22±0.79★32.99±1.33★ 0.55±0.33★<0.05活血生肌湯組 207.07±0.976.12±1.329.19±1.021.16±0.39 ★△ 1.44±0.64★△1.44±0.64 ★△33.66±1.46 ★△0.58±0.49★△<0.05

注：治療3個月后與常規治療組比較：★P<0.05，與干細胞移植組、活血生肌湯組比較差異有統計學意義；與干細胞移植組：△P<0.05與活血生肌湯組比較差異有統計學意義

3.2 3組治療3個月后血壓、血脂比較

表4顯示，與常規治療組比較，干細胞移植組、活血生肌湯組血壓、TC、TG、LDL-C、HDL-C降低，差異有統計學意義(P<0.05)，HDL-C較常規治療組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；活血生肌湯組TC、TG、LDL-C較常規治療組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，活血生肌湯組HDL-C較常規治療組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 治療3月后3組血脂比較(±s， mmHg， mmol/L)

表4 治療3月后3組血脂比較(±s， mmHg， mmol/L)

組別例數收縮壓舒張壓TCTGLDL-CHDL-CP值常規治療組20135.27±17.1276.60±6.804.76±0.972.15±2.112.76±0.701.12±0.25干細胞移植組20136.25±22.32★72.32±16.74★4.63±0.92★1.95±1.83★2.71±0.81★1.17±0.39★<0.05活血生肌湯組20132.23±32.3471.21±12.304.56±1.33★★1.69±1.24★★2.71±0.63★★1.32±0.30★★<0.01

注：治療3個月后與常規治療組比較：★P<0.05,★★P<0.01，干細胞移植組、活血生肌湯組血壓、TC、TG、LDL-C、 HDL-C比較差異有統計學意義， 活血生肌湯組TC、TG、LDL-C、 HDL-C差異有統計學意義

3.3 治療3個月后潰瘍面積及愈合率、創面肉芽組織中毛細血管數量比較

表5顯示，3組治療前對潰瘍面積及愈合率、創面肉芽組織中的毛細血管數量比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療3個月后，活血生肌湯組創面肉芽組織中毛細血管數量明顯多于常規治療組，差異有統計學意義(P<0.01)；活血生肌湯組多于干細胞移植組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 3組左側患足潰瘍面積/創面肉芽組織中毛細血管數量、愈合率比較 (±s，cm2)

表5 3組左側患足潰瘍面積/創面肉芽組織中毛細血管數量、愈合率比較 (±s，cm2)

組別例數治療前潰瘍面/毛細血管數量治療3個月后潰瘍面/毛細血管數量愈合率(%)P值常規治療組2016.4±7.6/ 6.66±0.5216.35±2.51/11.7±0.250/20(0.00)>0.05干細胞移植組2017.0±7.5/ 6.85±0.601.45±1.86★/ 15.3±0.6613/20(65.00)★<0.05活血生肌湯組2017.5±7.8/ 6.75±0.560.22±0.68★★ / 22.0±0.6319/20(96.43)★★<0.01

注：治療3個月后與常規治療組比較:★P<0.05,★★P<0.01(干細胞移植組、活血生肌湯組的潰瘍面/創面肉芽組織中毛細血管數量、愈合率比較差異有統計學意義，活血生肌湯組的潰瘍面/創面肉芽組織中毛細血管數量、愈合率比較差異有統計學意義)；與干細胞移植組比較：△P<0.05(活血生肌湯組差異有統計學意義)

3.4 治療3個月后選擇3組血管顯影典型病例比較

圖1顯示，常規治療組治療3個月后左膝下脛后動脈阻塞，干細胞移植組治療3個月后左脛后動脈暢通，活血生肌湯組治療3個月后血流直達左足部。

3.5 實驗室指標

表6、7顯示，患者治療3個月前后左下肢腘動脈管徑、足背動脈管徑及血流速度、左下肢正中、腓神經傳導速度進行比較。

圖1 治療3個月后常規治療組、干細胞移植組、活血生肌湯組血管造影比較

組別例數治療前/后腘動脈管徑 治療前/后腘動脈流速治療前/后足背動脈管徑治療前/后足背動脈流速P值常規治療組200.45±0.12/0.49±0.1346.25±5.32/48.96±4.260.24±0.02/0.27±0.0430.34±4.53/33.45±4.21>0.05干細胞移植組200.45±0.23/0.55±0.2246.42±4.42/62.43±4.210.24±0.02/0.40±0.1332.34±4.51/36.03±4.51<0.05活血生肌湯組200.44±0.22/0.96±0.2346.32±4.32/62.93±4.210.24±0.01/0.91±0.2332.24±4.41/36.03±4.51<0.05

表7 3組治療前后左下肢神經傳導速度變化比較(±s，mm/s)

表7 3組治療前后左下肢神經傳導速度變化比較(±s，mm/s)

組別例數治療前/后正中神經傳導速度 治療前/后腓神經傳導速度P值常規治療組2045.43±1.26/45.67±1.7136.21±1.02/37.56±1.21>0.05干細胞移植組2044.45±1.01/56.36±1.2136.17±0.33/46.31±0.63<0.05活血生肌湯組2044.55±1.11/44.55±1.1136.27±0.43/47.81±0.73<0.05

注：常規治療組2組比較差異無統計學意義(P>0.05)；干細胞移植組、活血生肌湯組2組比較差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞移植組、活血生肌湯組治療后的效果優于常規治療組(P<0.05)，活血生肌湯組優于干細胞移植組(P<0.05)

3.6 組織病理學觀察

圖2、3顯示，3組創面肉芽組織中毛細血管數量比較，治療前3組創面肉芽組織中的毛細血管數量差異無統計學意義(P>0.05)；治療3個月后，與常規治療組比較，活血生肌湯組創面肉芽組織中毛細血管數量明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01)；與干細胞移植組比較，活血生肌湯組差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組治療前創面組織病理學觀察(HE×200)注：3組創面肉芽組織中的毛細血管數量差異無統計學意義，P>0.05

圖3 各組治療3月后創面組織病理學觀察(HE×200)注：活血生肌湯組創面肉芽組織中毛細血管數量較常規治療組明顯增多，P<0.01；但較干細胞移植組毛細血管數量增多，P<0.05

3.7 安全指標評價

活血生肌湯組1例患者輕微惡心、嘔吐、腹痛，停用口服中藥1周內癥狀消失；其余組干細胞移植治療后精神、飲食、情緒、血、尿常規、心電圖、肝腎功能、外周血象均無異常。

4 討論

近年來，干細胞移植技術逐漸用于治療下肢缺血，移植到缺血處的干細胞逐漸分化并形成新生的毛細血管，可改善和恢復下肢血液循環，達到治療因糖尿病引起慢性下肢缺血的目的[5-6]。本次研究發現，自體骨髓干細胞移植組(活血生肌湯組、活血生肌湯組)治療3個月后腘動脈管徑、足背動脈管徑較移植前寬，腘動脈及足背動脈血流速度較移植前快，正中神經、腓神經傳導速度較移植前快，且干細胞移植組、活血生肌湯組治療后下肢血流及神經傳導速度的效果均優于常規治療組，且干細胞移植組、活血生肌湯組患者干細胞移植治療3個月后，左脛后動脈及左下肢動脈直達足底。本研究結果證實，自體骨髓干細胞移植治療糖尿病足下肢缺血效果是很明顯的。

干細胞移植之所以治療下肢缺血有效，是因為自體骨髓干細胞移植可以分化成血管內皮細胞和血管平滑肌細胞，直接形成新的血管；通過旁分泌形式生成多種血管生成因子，促進血管新生[7-9]；大量的動物實驗表明，骨髓干細胞移植能促使缺血的后肢生成新生血管。2002年Tateishi Yuyama等首次應用自體骨髓干細胞移植治療缺血性下肢血管病，取得了滿意的療效，且未發生明顯的不良反應[10-12]。本次研究發現，干細胞移植組、活血生肌湯組干細胞移植治療3個月后新生毛細血管數較常規治療組多，且無不良反應。該研究結果與資料是一致的，證實了自體骨髓干細胞移植后糖尿病足潰瘍新生血管的形成。

中醫認為，糖尿病足是由于“氣陰兩虛，瘀血阻絡”阻于四肢脈絡，氣血不能供養肌肉筋骨引起患肢的麻木疼痛或肢端壞疽。課題組認為，陰虛內熱是糖尿病發病的根本，而瘀血內停為糖尿病足病因，瘀血內停、脈絡血瘀滯流、閉塞不通導致下肢缺血壞死。本研究是在活血生肌湯具有改善糖尿病足下肢循環作用[13]的基礎上，在自體骨髓干細胞移植的同時合用活血生肌湯治療糖尿病足。

活血生肌湯方中的紅花、丹參、赤芍具有活血化瘀、改善糖尿病下肢微循環、促進病變組織的修復與再生，協同黨參、生黃芪、生地黃補氣、養血生津、止血祛瘀生肌的作用，加之乳香、川芎的活血行氣、解郁、通達、止痛之功效及黃柏的攻積滯、清濕熱等均可治療糖尿病足潰瘍。本次研究結果不論從一般指標還是客觀指標(血管顯影、動脈管徑、血流速度、神經傳導、毛細血管數量等)變化情況均證實，活血生肌湯具有活血通絡、祛瘀生肌、促進干細胞移植后血管新生、建立側枝循環的作用，研究結果為糖尿病足的治療提供了理論依據和方法。

本研究顯示，自體骨髓干細胞移植技術治療糖尿病足是有效的，活血生肌湯可以提高自體骨髓血干細胞移植技術的療效。