人參皂苷對腦缺血再灌注損傷星形膠質細胞增殖的影響及機制

任德啟 孟 毅 鄭偉峰 關東升 崔應麟

(河南省中醫院腦二病區，河南 鄭州 450000)

腦血管病具有高發病率、高致殘率、高死亡率的特點，其中最為常見的是缺血性腦血管疾病〔1〕。腦缺血發生后，可引起機體發生一系列的變化，包括葡萄糖和氧氣供應中斷、線粒體功能障礙、酸中毒、氧化應激、炎癥等，最終使神經元死亡〔2〕。在治療缺血性腦血管疾病時經常采用再灌注的方法，但會引起腦缺血再灌注損傷〔3〕。研究顯示，星形膠質細胞在保護神經元和腦損傷修復過程中發揮重要作用，例如產生抗氧化物質谷胱甘肽、分泌神經營養因子、促紅細胞生成素等〔4〕。實驗發現人參皂苷對大鼠大腦中動脈缺血引起神經元死亡具有阻止作用〔5〕。本實驗旨在研究人參皂苷對體外培養的腦缺血再灌注損傷星形膠質細胞增殖、凋亡、活性氧(ROS)的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 出生1～3 d的SD大鼠購自上海凱學生物科技有限公司；DMEM/F-12培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；人參皂苷購自浙江亞克藥業有限公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天科技有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2一抗、Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗、細胞周期蛋白(Cyclin)D1一抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH )一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Sigma公司。

1.2細胞的分離與培養 在無菌條件下分離出SD大鼠腦組織，立即用冰冷的解剖液清洗去除殘留血液，顯微鏡下分離出大腦皮質，眼科剪剪成1 mm3左右的碎塊，玻璃吸管反復吹打，加入0.25%的胰酶常溫下消化20 min，反復4次，離心，棄上清，將洗滌后的星形膠質細胞制成單細胞懸液，接種于含10%胎牛血清(FBS)和雙抗的細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每天觀察細胞生長狀態，每2～3 d更換一次培養基，待細胞融合度達到80%左右時，胰酶消化傳代。待對數期細胞的純度達到90%可用于后續實驗。

1.3星形膠質細胞缺血再灌注損傷模型的建立 將細胞濃度調整為1×105/ml接種于96孔板中，采用無糖DMEM培養基培養，將其放入恒溫培養箱中，充入5%CO2、1%O2、94%N2培養2 h，然后將培養基更換為含有10% FBS的高糖培養基，放入37℃、5%CO2培養箱中繼續培養4 h，即為缺血再灌注模型。

1.4實驗分組和藥物干預 取100 μl 1×105/ml的細胞接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，分別加入5、10、20、40、80 μg/ml的人參皂苷，每孔5個復孔，放入37℃、5%CO2培養箱中培養3 d。實驗分為3組：對照組為未經處理的細胞；模型組為缺血再灌注細胞，不加藥物處理；給藥組為缺血再灌注細胞，分別加入人參皂苷。

1.5噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖 取1×105個各組對數期細胞接種于96孔板中，培養48 h，每孔5個復孔，根據試劑說明書進行實驗，加入500 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，直至出現結晶紫后終止實驗，在570 nm波長下記錄各孔的吸光值(OD值)。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對照組、模型組、給藥組(20 μg/ml)細胞培養48 h，0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細胞，調整細胞濃度1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC，避光條件下置于37℃下孵育30 min，加入5 μl碘化丙啶(PI)，避光反應5 min。置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7ROS檢測 對照組、模型組、給藥組(20 μg/ml)對數期細胞密度調整為1×105/ml接種于6孔培養板，分組處理后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，離心，棄上清，加入10 μmol/L DCFH-DA懸浮細胞，常溫下避光反應30 min，PBS清洗2次，上流式細胞儀檢測細胞內ROS的水平。

1.8Western印跡檢測細胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1蛋白表達 收集對照組、模型組、給藥組(20 μg/ml)細胞，加入0.5 μmol蛋白酶抑制劑，振蕩混合均勻，置于冰上反應10 min，16 000 r/min離心10 min，所得上清即為所需蛋白，根據聚氰丙烯酸正丁酯(BCA)試劑說明書檢測蛋白濃度。在蛋白樣品中加入4倍體積的5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白緩沖液，100℃煮沸10 min。配制10%分離膠和5%濃縮膠加入玻璃板中，置于電泳池中，80 V電泳20 min，然后120 V電泳至溴酚蘭到達分離膠底部，停止電泳。將SDS-PAGE 120 V電壓轉膜150 min，取出轉膜后的硝酸纖維素膜，使用5%脫脂奶粉置于搖床上封閉60 min，PBST清洗3次×5 min，加入提前稀釋的一抗，4℃冰箱中孵育過夜，然后37℃恒溫箱中復溫，PBST清洗3次×5 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃下孵育60 min，PBST清洗3次×5 min，滴加電化學發光(ECL)發光液，暗室中曝光，加入顯影液和定影液，晾干膠片，Image J軟件分析目的蛋白表達水平。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0統計軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度人參皂苷對細胞增殖的影響 與對照組(0.684±0.076)相比，模型組細胞OD值(0.340±0.021)顯著降低(t=7.557，P=0.002)，人參皂苷只有20 μg/ml時OD值(0.882±0.083)顯著高于對照組(t=3.047，P=0.038)，與模型組相比，給藥組細胞OD值顯著增高(F=20.384，P=0.000)，其中5 μg/ml時0.709±0.075，10 μg/ml時0.747±0.068,40 μg/ml時0.721±0.090，80 μg/ml時0.715±0.058，20 μg/ml為人參皂苷的最佳給藥量，后續實驗均以20 μg/ml人參皂苷為實驗對象。

2.2人參皂苷對細胞凋亡的影響 與對照組(10.356%±1.428%)相比，模型組和給藥組細胞凋亡率(42.486%±6.753%，20.145%±4.657%)顯著增高(t=8.063，3.481；P=0.001，0.025)；與模型組相比，給藥組顯著降低(t=4.717，P=0.009)。

2.3人參皂苷對ROS水平的影響 與對照組(100.036%±0.012%)相比，模型組和給藥組ROS的表達量(254.353%±6.879%，150.521%±10.639%)顯著增加(t=15.835，8.219，P=0.000，0.001)，與模型組相比，給藥組顯著降低(t=9.014，P=0.001)。

2.4人參皂苷對細胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1蛋白水平的影響 與對照組相比，模型組和給藥組Bcl-2(t=11.357，3.130；P=0.000，0.035)、CyclinD1(t=10.880，6.574；P=0.000，0.003)蛋白表達量顯著降低，Bax蛋白表達量顯著升高(t=7.715，5.626；P=0.002，0.005)；與模型組相比，給藥組Bcl-2、CyclinD1蛋白表達量顯著升高(t=10.212，4.545；P=0.001，0.011)，Bax蛋白表達量顯著降低(t=3.656，P=0.022)。見圖1，表1。

圖1 人參皂苷對細胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1蛋白水平的影響

組別Bcl-2BaxCyclinD1對照組0.765±0.0730.285±0.0160.822±0.069模型組0.272±0.0181)0.553±0.0581)0.361±0.0251)給藥組0.602±0.0531)2)0.410±0.0351)2)0.503±0.0481)2)

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

3 討 論

臨床上最常見的腦血管疾病是缺血性腦血管病變〔6〕。腦缺血再灌注能夠引起神經中毒、組織出血、氧化損傷、炎癥反應、膠質細胞壞死等，嚴重影響患者的預后〔7〕。研究表明，星形膠質細胞對腦缺血再灌注損傷過程中的神經功能恢復具有積極或消極的作用〔8〕。星形膠質細胞是神經細胞中數量較多的一類細胞，對神經元功能的維持、神經細胞內pH值和體液平衡、離子濃度、血流量具有重要作用，參與新陳代謝、形成血腦屏障等生物學作用〔9〕。大量研究表明，星形膠質細胞在腦缺血再灌注損傷中的細胞內產生一定量的功能因子，如多種功能的神經營養因子、細胞因子，當細胞的通透性增強時，這些因子以胞吐等形式進入細胞液中，發揮對神經元的保護作用〔10,11〕。研究表明以天麻和鉤藤(主要成分為天麻素和鉤藤堿)為主的中藥制劑對腦缺血再灌注4 h的星形膠質細胞的存活率具有一定保護作用，說明某些中藥可緩解腦缺血再灌注損傷導致的星形膠質細胞的凋亡作用〔12〕。擬人參皂苷在大鼠腦缺血組織損傷的病理過程中，可減小腦梗死的面積，增強抗氧化能力〔13〕，但其具體的作用機制不太清楚。本實驗結果發現腦缺血再灌注損傷促進星形膠質細胞凋亡，抑制其增殖，人參皂苷對星形膠質細胞具有一定的保護作用。

細胞凋亡是正常細胞為維持內環境穩定而發生的自主、有序性死亡，受多種基因的調控，如Bcl-2、Bax、CyclinD1等〔14〕。凋亡相關基因的變化在細胞凋亡中起重要作用。Bcl-2基因表達量升高可抑制細胞的凋亡，是一種抑制凋亡的癌基因；Bax表達水平的升高可促進細胞的凋亡，是一種促細胞凋亡基因〔15〕。 在調節細胞凋亡的過程中，Bcl-2和Bax可形成二聚體而發揮作用〔16〕。CyclinD1是一種原癌基因，調控細胞的生長、分化過程，通過與CDK6結合形成復合物，促進細胞有絲分裂從G1期向S期轉變，縮短細胞周期，從而促進細胞增殖〔17〕。ROS參與細胞氧化應激過程是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一，正常狀態下，機體內的ROS含量處于動態平衡狀態，但當機體受到異常刺激時，如再灌注時機體內的分子氧大量增加，ROS大量產生，超出機體的清除能力，導致ROS在細胞內累積并釋放細胞毒，誘導細胞凋亡〔18〕。所以ROS的產生是腦缺血再灌注損傷的一個重要過程。本實驗結果發現，腦缺血再灌注損傷使星形膠質細胞中ROS、Bax的含量顯著增加，Bcl-2、CyclinD1的表達量顯著降低，但人參皂苷可逆轉再灌注損傷的作用。

綜上，腦缺血再灌注損傷可促進星形膠質細胞凋亡，抑制其增殖，但人參皂苷具有抗星形膠質細胞再灌注損傷的作用，其作用機制可能是通過調節細胞內氧化應激、凋亡相關蛋白的表達來發揮作用。