右美托咪定對腦缺血再灌注損傷大鼠神經的保護作用及機制

邢 娜 李平樂 張建文 邢利卡 張 衛

(鄭州大學第一附屬醫院麻醉科，河南 鄭州 450052)

右美托咪定(DEX)屬于α2腎上腺素受體激動劑，廣泛應用于外科手術麻醉〔1〕。近年來發現，DEX還具有神經保護功能〔2〕，然而其內在作用機制尚未被完全闡明。免疫炎癥應答在神經保護中發揮重要作用，有研究發現〔3〕，DEX能夠通過激活α2腎上腺素受體信號通路發揮抗炎作用，減少炎癥細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β等。Toll樣受體(TLRs)在體內廣泛存在，是炎癥信號傳遞的門戶蛋白，與相應的配體(如多種致病原)結合后，促進炎癥介質的釋放〔4〕。TLR-4是TLRs家族成員之一，在腦缺血過程中被激活，進而引發一系列炎癥級聯反應〔5〕；此外，TLR-4還能夠激活核因子(NF)-κB信號通路，進一步啟動多種炎癥因子的基因轉錄翻譯。已有研究證實，在肝臟、肺等多種器官發生缺血過程中，DEX能夠抑制TLR-4介導的炎癥反應，減輕再灌注損傷〔6，7〕。然而，在腦缺血過程中，DEX能否減輕再灌注損傷，目前的報道尚少。本研究旨在探討DEX在腦缺血再灌注(CIR)損傷中是否發揮神經保護作用，并且是否與TLR-4/NF-κB信號通路有關，為CIR損傷相關研究提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物模型的構建和實驗分組 雄性SD大鼠40只，體重250～300 g，周齡12～16 w，購于河南省實驗動物中心，合格證號：SYXK(豫)2016-0002。本研究經醫院動物倫理委員會審核批準，實驗過程遵守《實驗動物管理條例》。

大鼠適應性飼養1 w，隨機分為假手術組、模型組、DEX組(100 μg/kg DEX，腹腔注射，術前30 min)、瑞沙托維(RES，3 mg/kg RES，腹腔注射，術前30 min)組，每組10只。各組大鼠周齡、體重差異無統計學意義(均P>0.05)。

采用大腦中動脈閉塞(MCAO)法進行CIR大鼠模型誘導〔8〕：術前所有大鼠禁食12～16 h，在此期間自由飲水，手術開始前所有大鼠進行稱重，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g，腹腔注射)麻醉，仰臥位固定于手術臺上，讓大鼠的頸部充分暴露，行常規消毒，在大鼠頸正中切口，切開長度2.0 cm左右，逐層分離，讓左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)充分暴露，微血管動脈夾暫時夾閉CCA和ICA，于ECA做V形切口，將制備好的線栓插入，去除ICA的微動脈夾，將線從ECA插入，進入ICA顱內段，進入長度約距CAA分叉處(12.0±0.5)mm，當進線遇輕微阻力，栓線正好堵住大腦中動脈的開口。線栓堵住左側大腦中動脈的開口，阻斷60 min后，拔出線栓，扎緊動脈殘端，縫合傷口，完成CIR模型誘導。假手術組只分離血管，不結扎血管，不置入線栓。

1.2神經功能評分 神經癥狀評分采用單盲法。CIR術后2 h及24 h后，采用Longa神經功能評分法〔9〕進行神經功能評分，評分標準：無神經損傷癥狀(0分)；提尾時病灶對側前肢不能完全伸直(1分)；行走時向癱瘓側轉圈(2分)；行走時向病灶對側跌倒(3分)；不能自發行走，意識喪失(4分)。評分為0分及4分，視為造模不成功。最終，模型組、DEX組和RES組各有8只CIR大鼠，假手術組有10只大鼠。

1.3腦組織氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 CIR術后24 h，每組隨機取4只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，隨后采用0.9%氯化鈉溶液250 ml經左心室灌流，迅速斷頭取腦，迅速置于液氮中冷凍10 min，去除嗅腦和腦干，自視交叉處向后連續做4個冠狀位切片，厚約2 mm。腦片浸入2% TTC溶液，37℃恒溫水浴中孵育15 min染色，染色后取出，于4%多聚甲醛中固定24 h后，觀察腦組織梗死情況(紅色區域為正常腦組織，蒼白色區域為梗死區)，采用Motic Med 6.0 System計算腦梗死體積。

1.4TUNEL染色 CIR術后24 h，每組剩余大鼠經腹腔注射10%水合氯醛，0.9%氯化鈉溶液250 ml經左心室灌流，然后迅速斷頭取腦，迅速置于液氮中冷凍10 min，將腦橫切為2部分，一部分用TUNEL染色，另一部分用于Western印跡實驗(液氮保存)。

4%中性甲醛固定腦組織，常規脫水石蠟包埋，切片，采用TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)進行組織染色，操作步驟嚴格參照試劑盒說明書。TUNEL染色陽性細胞呈棕黃色，圓形或橢圓形，細胞核呈固縮狀態，偶見核碎裂。高倍顯微鏡(×200，BX41，日本OLYMPUS公司)下，各切片取5個互不重疊的視野，對各組大鼠海馬CA1區的凋亡細胞(TUNEL染色陽性細胞)和正常細胞(TUNEL染色陰性細胞)進行計數，計算凋亡細胞占總細胞數的百分比。

1.5Western印跡實驗 取出液氮保存的腦組織，勻漿后，一部分用于總蛋白的提取，用于檢測TLR-4、p-IκB和GAPDH蛋白表達(RIPA裂解液，上海碧云天生物技術有限公司)，另一部分用于核蛋白的提取，用于檢測NF-κB p65和組蛋白H3蛋白表達(核蛋白提取試劑盒，美國Thermo公司)，BCA試劑盒(美國Thermo公司)檢測總蛋白及核蛋白濃度。

10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，羊抗大鼠單克隆抗體TLR-4(美國Santa公司)，羊抗大鼠單克隆抗體NF-κB p65(美國Santa公司)，羊抗大鼠單克隆抗體p-IκB(美國Santa公司)，總蛋白內參GAPDH抗體(美國Santa公司)，核蛋白內參組蛋白H3抗體(美國Santa公司)，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊二抗(北京博奧森生物技術公司)，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜后，加ECL發光液(美國Millipore公司)，凝膠成像儀(ChemiDoc-It 510，美國UVP公司)進行化學發光顯影，檢測各蛋白的顯影條帶，并對蛋白顯影條帶進行灰度分析(Image Lab軟件)，計算目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值，進行統計分析。

2 結 果

2.1DEX明顯改善神經功能缺損 單因素方差分析顯示，術后2 h及24 h的神經功能評分四組間整體差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較：CIR術后2 h，假手術組神經功能表現正常，而模型組、DEX組及RES組均出現了明顯的神經功能缺損癥狀(t=2.885，P=0.012；t=2.398，P=0.031；t=2.739，P=0.016)，提示CIR大鼠模型建立成功。CIR術后24 h，DEX組與模型組相比，神經功能顯著改善(t=2.433，P=0.029)，與RES之間差異無統計學意義(t=1.874，P=0.082)，表明DEX治療與RES治療一樣，均能夠改善CIR損傷導致的神經功能缺損癥狀，從而起到神經保護作用。見表1。

表1 各組大鼠CIR術后2 h及24 h的神經功能評分分)

2.2DEX明顯減少腦梗死 CIR術后24 h，TTC染色法直接觀察DEX對大鼠腦梗死區域的影響，梗死區域主要位于額頂葉皮質和尾殼核，TTC染色為白色；正常組織TTC染色為紅色，部分組織可見白色向紅色過渡，為半暗區。假手術組沒有明顯白色梗死區域，模型組可見明顯較大范圍的白色梗死區域，DEX組和RES組的白色梗死范圍均顯著小于模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色比較

采用Motic Med 6.0 System計算腦梗死體積百分比，經方差分析，四組間整體差異有統計學意義(F=7.291，P=0.007)。兩兩比較并結合主要數據分析：DEX組腦梗死體積〔(25.39±5.18)%〕顯著低于模型組〔(34.85±6.82)%，t=4.199，P=0.003〕，而與RES組〔(27.63±4.91)%〕之間差異無統計學意義(t=1.965，P=0.085)。

CIR術后24 h，TUNEL染色結果顯示，假手術組無TUNEL染色陽性細胞，而模型組、DEX組和RES組的大腦海馬CA1區均可見大量TUNEL染色陽性的凋亡細胞。見圖2。

圖2 各組大鼠CIR術后24 h海馬CA1區TUNEL染色比較(×200)

統計結果顯示：凋亡細胞比例的四組間整體比較(單因素方差分析)差異有統計學意義(F=9.285，P<0.05)，兩兩比較并結合主要數據分析：DEX組凋亡細胞比例〔(31.38±3.27)%〕明顯低于模型組〔(43.94±5.27)%;t=2.702，P=0.027〕，而與RES組〔(29.71±3.12)%〕相比差異無統計學意義(t=1.763，P=0.116)。

2.3DEX可抑制腦組織TLR-4/NF-κB信號通路活性 CIR術后24 h，方差分析顯示整體差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合主要數據分析：與模型組相比，DEX組大鼠腦組織中大鼠腦組織TLR-4、p65、p-IκB蛋白表達水平均顯著降低(t=3.806，P=0.019；t=3.588，P=0.023；t=2.949，P=0.042)，而與RES組之間差異無統計學意義(t=2.570，P=0.062；t=2.720，P=0.053；t=2.097，P=0.104)。見表2和圖3。

圖3 各組大鼠CIR術后24 h，腦組織TLR-4、p65、p-IκB蛋白的Western印跡曝光圖

組別TLR-4p65p-IκB假手術組1.03±0.130.97±0.180.97±0.21模型組3.651±0.923.21±0.832.43±0.87DEX組1.95±0.292.61±0.821.52±0.72RES組2.13±0.352.31±1.221.39±0.92F值11.29317.23610.376P值0.0000.0000.000

3 討 論

CIR損傷是由腦組織缺血、恢復血流再灌注后引發的腦組織及神經細胞損害加重的現象。CIR損傷是多因素共同作用的結果，其發生機制復雜〔10〕，炎癥是導致CIR損傷的病理機制之一〔11，12〕。TLRs是參與急性炎癥反應與天然免疫應答的主要物質，多種致病原、細胞因子及環境壓力均能夠誘導TLRs快速激活〔13〕。TLRs家族成員分布在不同的組織器官，其中TLR-4參與調節大腦對外界壓力的應答，TLR-4參與了CIR損傷中的大腦損傷和炎癥反應。有研究結果表明，在CIR損傷后，小神經膠質細胞，神經元和星形細胞中TLR-4的表達水平顯著增加〔14〕。NF-κB信號通路在TLR-4介導的炎癥反應中占重要地位，TLR-4可在腦缺血后識別腦組織細胞釋放的熱休克蛋白、透明質酸等內源性物質，導致自身發生二聚化，進而逐步激活NF-κB。NF-κB在如炎癥反應、細胞凋亡等多種生理病理過程發揮作用，是一種重要的核轉錄因子。在正常細胞中，NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結合，以無活性形式存在于細胞質。當細胞被外界剌激時，經TLR-4信號轉導后，激活IκB激酶(IKK)，導致IκB被磷酸化(即p-IκB)、泛素化后降解。這使得被IκB抑制的NF-κB游離釋放，NF-κB p65由細胞質進入細胞核，發揮生物學效應。本研究表明在CIR損傷的病理生理過程中TLR-4/NF-κB信號通路激活發揮著重要的作用。已有多種TLR-4抑制劑被證實能夠降低CIR損傷。在多種動物模型中發現，TLR-4特異性抑制劑-RES能夠通過調節與TLR-4/NF-κB信號通路相關的炎癥反應，發揮神經細胞保護的作用〔7〕。銀杏苦內酯B和孕酮作為TLR-4非特異性抑制劑，也能夠通過抑制TLR-4信號通路對神經細胞起保護作用，同時減輕炎癥反應〔15〕。本研究結果也顯示，接受RES預處理的RES組大鼠腦組織中TLR-4/NF-κB信號通路活性明顯低于模型組大鼠，且神經功能缺損癥狀也得到顯著改善，證實在大鼠CIR損傷過程中，RES確實能夠通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路活性發揮神經保護作用，在本研究中，RES組作為陽性對照組。 DEX能夠通過抑制炎癥反應，發揮神經保護作用。有研究結果表明，DEX能夠通過降低TLR-4/NF-κB信號通路活性發揮抗炎作用，從而對腎臟和肺具有保護作用〔16〕。也有研究結果表明，DEX可能通過其他途徑發揮神經保護作用，如減少鈣離子內流，發揮抗氧化作用，抑制興奮性神經遞質，抗凋亡等〔17〕。綜上所述，DEX可以減輕CIR大鼠的再灌注損傷，其機制可能是通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路上的關鍵信號分子TLR-4、NF-κB p65、p-IκB的蛋白表達，抑制TLR-4/NF-κB信號通路活性，從而減輕CIR過程中的炎癥反應，減小腦梗死體積，讓神經功能缺損情況得到改善，起到神經保護作用。但TLR-4/NF-κB信號通路對CIR中神經細胞凋亡的調控是一個多方向、多途徑的過程，因此，仍需要大量的后續實驗對其作用及其機制記憶補充和全面闡釋。