考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定歸及乳膏中植物蛋白的含量*

潘 濤，陳 芳，陶平德，常明泉△（.鄖西縣人民醫(yī)院藥劑科，湖北 十堰44600；.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北十堰44000）

歸及乳膏是湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院與鄖西縣人民醫(yī)院共同開發(fā)的中藥軟膏制劑，該乳膏以當(dāng)歸浸膏、白及溶膠為主藥[1]，加基質(zhì)經(jīng)乳化而成，具有清除皮膚自由基、軟化角質(zhì)、抗氧化、保濕潤(rùn)膚的功效，用于治療皮膚皸裂[2-5]。前期作者以多糖為指標(biāo)，對(duì)該乳膏的質(zhì)量控制、體外釋放度等內(nèi)容進(jìn)行過(guò)一些相關(guān)研究[6-8]。為了進(jìn)一步明確其活性成分和藥理作用，更好地控制歸及乳膏質(zhì)量，為開展后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，作者采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)其中的植物蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 TU-1901型分光光度儀（北京普析通通用儀器有限責(zé)任公司），BCD-610W型冰箱（博西華家用電器有限公司，功率：1.07 kW），KM-410C型超聲震蕩儀（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，頻率：40 kHZ），WGAUNI-10型超純水器（北京普析通儀器有限責(zé)任公司，功率：300 W），F(xiàn)A-2004型電子分析天平（上海精密儀器有限公司，精度：0.000 1 g），MH-1000型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司，功率：300 W），試管架（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：13 cm×50 cm），玻璃試管（10、20 mL）。

1.1.2 試藥 歸及乳膏（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：20171712、20170723、20170809），牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140619-201622，規(guī)格：23.5毫克/瓶），考馬斯亮藍(lán)G-250（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：6401-58-1），無(wú)水乙醇（武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào)：20161225），85%磷酸溶液（武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào)：20161212），氯化鈉（NaCl）（沈陽(yáng)試劑廠，批號(hào)：2016010599，含量 95.00%～100.00%，基準(zhǔn)試劑），純化水（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備 （1）0.15 mol/L Nacl溶液：精密稱取0.438 7 g Nacl于50 mL容量瓶中，加純化水溶解，定容，即得。（2）考馬斯亮藍(lán)溶液：精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 50 mg溶于25 mL乙醇中，加入85%磷酸溶液50 mL，混合，加純化水稀釋至 500 mL，即得。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：精密稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置10 mL容量瓶中，加純化水溶解，定容，即得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照品儲(chǔ)備液，置冰箱中低溫保存（4℃），取該溶液0.2 mL于試管中，加0.15 mol/L Nacl溶液至2.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0 mL，混勻，在室溫放置5 min，即得。（4）供試品溶液：精密稱取歸及乳膏0.25 g于燒杯中，加無(wú)水乙醇約20 mL，超聲溶解，過(guò)濾至50 ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇洗滌燒杯3次（每次約8 mL），集中濾液，用無(wú)水乙醇定容，取該溶液0.6 mL于試管中，加0.15 mol/L Nacl溶液至2.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0 mL，混勻，放置 5 min，即得。（5）空白溶液：精密吸取0.15 mol/L氯化鈉溶液2 mL于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0 mL混勻，在室溫放置5 min，即得。

1.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取“1.2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、供試品溶液和空白樣品溶液，在分光光度儀上于500～700 nm波長(zhǎng)處掃描，記錄掃描圖。

1.2.3 曲線方程的建立 分別精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下濃度為 1.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL試管中，每管加0.15 mol/L Nacl溶液至1.0 mL，混勻，各取0.1 mL于對(duì)應(yīng)編號(hào)的新試管中，分別加入考馬斯亮藍(lán)溶液5.0 mL混勻，室溫放置5 min，即得毎毫升含標(biāo)準(zhǔn)蛋白為 3.92、7.84、11.76、15.69、19.61μg的溶液，取各溶液分別在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），吸收度值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 取“1.2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在595 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定5次，記錄吸光度值。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在595 nm 波長(zhǎng)處分別于0、1、3、6 h測(cè)定吸光度，記錄吸光度值。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行精密稱取歸及乳膏0.25 g于試管中，共5份，按“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備樣品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

1.2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的歸及乳膏（批號(hào)：20170723）0.125 g共9份，毎3份為1組，分別按樣品含量的80%、100%、120%加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。

1.2.8 含量測(cè)定 精密稱取歸及乳膏0.25 g（批號(hào)：20171712、20170723、20170809）于燒杯中，每個(gè)批號(hào)各3份，按“1.2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在分光光度儀上于595 nm處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算含量。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、供試品溶液均在595 nm處有最大吸收，空白樣品溶液在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，選擇595 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，掃描圖見圖1。

圖1 紫外線掃描圖

2.2 曲線方程的建立 得曲線方程為Y=0.036 0X?0.000 5，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 5，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在 3.92～19.61μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.77%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為1.89%，表明標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)RSD為1.34%。

2.6 回收率試驗(yàn) 平均回收率為94.3%，RSD為1.91%。見表1。

2.7 含量測(cè)定 歸及乳膏樣品批號(hào)為20171712、20170723、20170809 的樣品含量分別為 51.7、52.2、49.9 mg，RSD分別為 1.22%、1.47%、1.81%。

表1 歸及乳膏中植物蛋白回收率試驗(yàn)（n=9）

3 討 論

本研究中，考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合后呈藍(lán)色，在595 nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)與染色劑的結(jié)合量與測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度值成正比[8]，因此采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定歸及乳膏中的植物蛋白含量。在制備供試品溶液時(shí)，曾使用純化水、10%Nacl溶液、乙醇-氯仿（1∶1）混合液做乳膏的溶劑，超聲處理，對(duì)液體分別應(yīng)用離心、過(guò)濾等方法，但效果都不理想，而采用無(wú)水乙醇做溶劑，則溶解效果好、速度快，所制備的溶液澄清，檢出效果良好。作者曾考慮到植物蛋白在酸、堿、丙酮、乙醇中會(huì)受到影響。是否因?yàn)橹参锏鞍妆砻嬗幸粚永w維膜，對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)是否具有保護(hù)作用，后續(xù)將進(jìn)行深入研究。

歸及乳膏中的蛋白屬于植物蛋白，成分比較復(fù)雜，不僅其含有多糖、植物蛋白，還含有植物色素等物質(zhì)[9]，植物色素可能也產(chǎn)生一定的光密度值，所以在配制樣品時(shí)應(yīng)使蛋白質(zhì)濃度在0.1 mg/mL以內(nèi)，必要時(shí)適當(dāng)增加考馬斯亮藍(lán)染色液的用量，以保證與蛋白質(zhì)染色反應(yīng)完全，克服其他成分對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定產(chǎn)生的影響[10]。酸堿對(duì)植物蛋白的測(cè)定會(huì)有一定影響，配制檢測(cè)溶液時(shí)加入0.15 mol/L Nacl溶液稀釋，可緩沖其影響。在測(cè)定試驗(yàn)前應(yīng)把本研究所用器具用鉻酸鉀清潔液浸泡、用純化水清洗干凈，并避免使用石英吸收池，防止用具不潔對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾，每次測(cè)定完畢用乙醇清洗比色皿，然后用純化水清洗，以免考馬斯亮藍(lán)染色液在比色皿上存在殘留。