解偶聯(lián)蛋白2過表達對膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體的保護作用

鄭貴浪，郭予雄，呂娟娟，黃錦達，劉 翠，曾其毅

(1.廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學科學院兒科，廣東 廣州 510030；2.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510220)

膿毒癥是由感染誘發(fā)的機體調節(jié)失衡所致的危及生命的器官功能障礙[1]，其高發(fā)病率和高死亡率耗費了大量的醫(yī)療資源。研究[2]顯示：膿毒癥時心功能障礙的發(fā)生率高達40%，且與其導致的線粒體功能障礙有關。解偶聯(lián)蛋白2 ( uncoupling protein 2 ，UCP2)屬于線粒體陰離子通道家族成員之一，廣泛分布于心、肺和腦等器官和組織中，在多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。研究[3]表明：UCP2參與動脈粥樣硬化的形成，參與免疫應答反應、食物的攝入和多種代謝性疾病的病理生理過程。體內外研究[3-4]顯示：UCP2上調可以通過調控膜電位進而保護神經(jīng)元，而UCP2基因敲除則會導致線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生明顯增多以致?lián)p害神經(jīng)元。近年來研究[5]顯示：UCP2可作為臨床嚴重膿毒癥的特異性標記物。對于心肌細胞，尤其在膿毒癥狀態(tài)下的心肌細胞中UCP2的作用，近年來報道較少。本課題組前期研究[6]顯示：通過干擾心肌中UCP2的表達，膿毒癥可使心肌細胞線粒體結構及功能明顯受損。為進一步揭示UCP2的作用，本研究在構建UCP2過表達的穩(wěn)轉株心肌細胞基礎上，采用脂多糖/聚糖肽(LPS/PepG)刺激心肌細胞，通過檢測線粒體形態(tài)與功能的相關指標，揭示UCP2在膿毒癥心肌細胞中的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 UCP2過表達H9C2心肌細胞穩(wěn)定株的構建提取大鼠總RNA，采用常規(guī)基因操作技術，將UCP2基因構建到pMD19-T質粒；以EcoRⅠ和NotⅠ為插入位點，將UCP2基因克隆到慢病毒載體(PHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro穿梭載體)，通過慢病毒包裝及滴度測定，將克隆成功的UCP2慢病毒穿梭載體感染H9C2心肌細胞，篩選出UCP2過表達H9C2細胞株進行實驗。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組將H9C2心肌細胞隨機分成4組：①正常對照組，給予等量生理鹽水刺激；② LPS/PepG 刺激組，同時給予LPS和PepG刺激；③ 空病毒組，空病毒載體(PHBLV)轉染H9C2細胞，同時給予LPS和PepG刺激；④ 過表達組，UCP2過表達H9C2細胞同時給予LPS和PepG刺激。上述LPS終濃度為2 mg·L-1，PepG終濃度為 20 mg·L-1。

1.3 RT-PCR和Western blotting法檢測心肌細胞中UCP2 mRNA和蛋白表達水平① RT-PCR法。UCP2引物：GGGCACCTGTGGTGCTACCTG(R)，ATGAGCTTTGCCTCCGTCCGC(F)，擴增片段長度為118 bp；GAPDH引物：GAAGATGGTGATGGGTTTCC(R),CTACAACGACCCCTTCA-TTG(F)，擴增片段長度為136 bp；18sRNA引物:CCATCCAATCGG TAGTAGC(R),GTAATGGCGG GTCATAAG(F)，擴增片段長度為80 bp。TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄反應，實時熒光定量PCR擴增目的基因。根據(jù)實時熒光定量PCR儀檢測到的SYBR Green Ⅱ的熒光信號，計算目的基因UCP2的相對表達水平，即目的基因的表達水平相對于對照組的變化倍數(shù)。② Western blotting法。裂解液裂解H9C2細胞，離心后取上清，提取總蛋白并測定蛋白濃度；根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；提取總蛋白，加入SDS蛋白上樣緩沖液煮沸保存?zhèn)溆茫籛estern blotting 法檢測蛋白表達，采用化學發(fā)光法(ECL)進行顯影。利用Kodak In-Vivo Imagine System F化學發(fā)光/活體成像分析系統(tǒng)采集圖像，Gel-Pro analyzer 4.0軟件比較各條帶的灰度值，計算目的蛋白的表達水平。

1.4 心肌細胞中肌酸激酶(CK)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平檢測采用分光光度計法檢測心肌細胞中CK水平，采用ELISA法檢測心肌細胞中TNF-α水平，具體操作步驟按試劑盒說明書進行(CK測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，ELISA試劑盒購自北京博凌科為生物科技有限公司)。CK水平升高提示心肌細胞損害，TNF-α水平升高提示炎癥信號通路啟動。

1.5 電鏡觀察線粒體超微結構常規(guī)制備培養(yǎng)的H9C2心肌細胞的電鏡標本，超薄切片染色后電鏡觀察H9C2細胞線粒體的超微結構。

1.6 流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位(MMP)水平采用一種陽離子脂質熒光染料JC-1作為檢測MMP指示劑。JC-1在低濃度時可發(fā)射綠色熒光，高濃度時發(fā)射光為紅色熒光。MMP升高時，JC-1聚合體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值升高；MMP下降時，JC-1單體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值降低。利用這一特性，本實驗通過流式細胞術及激光共聚焦技術檢測各組心肌細胞中MMP水平，同時設陽性對照組。具體操作步驟按照細胞線粒體分離試劑盒(南京建成生物科技有限公司，貨號G003)和MMP檢測試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號KGA604)說明書進行。

1.7 多功能酶標儀檢測心肌細胞中線粒體ROS和三磷酸腺苷(ATP)水平采用多功能酶標儀檢測心肌細胞中線粒體 ROS和ATP水平。具體操作步驟按試劑盒說明書進行。ROS檢測試劑盒(貨號S0033)和ATP檢測試劑盒(貨號A016-1)均購自碧云天生物技術研究所。

2 結 果

2.1 各組H9C2心肌細胞中UCP2 mRNA和蛋白表達水平與正常對照組比較，LPS/PepG 刺激組 H9C2心肌細胞中UCP2 mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P< 0.05)；過表達組H9C2心肌細胞中UCP2 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于正常對照組、LPS/PepG 刺激組和空病毒組(P< 0.05)；與LPS/PepG 刺激組比較，空病毒組H9C2心肌細胞中UCP2 mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果提示H9C2心肌細胞UCP2過表達模型構建成功。見圖1和表1。

Lane 1:Normal control group;Lane 2:LPS/PePG group;Lane 3:PHBLV group;Lane 4:PHBLV-UCP2 group.

圖1 各組H9C2心肌細胞中UCP2蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of UCP2 protein in H9C2 cells in various groups

2.2 各組H9C2心肌細胞中CK和TNF-α水平 與正常對照組比較， LPS/PepG 刺激組H9C2心肌細胞中CK和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與LPS/PepG 刺激組和空病毒組比較，過表達組H9C2細胞中CK和TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。空病毒組H9C2心肌細胞中CK和TNF-α水平與LPS/PepG 刺激組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 各組H9C2心肌細胞線粒體超微結構 電鏡下觀察：正常對照組心肌細胞線粒體邊界清楚，基質均勻，線粒體嵴致密，形態(tài)正常。LPS/PepG 刺激組心肌細胞線粒體邊界模糊不清，體積腫脹明顯，基質密度降低，部分線粒體內膜破裂、嵴疏松溶解，甚至出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，可見空泡樣變。與LPS/PepG 刺激組比較，過表達組心肌細胞線粒體形態(tài)有所改善，表現(xiàn)為線粒體腫脹減輕，基質密度增高，內膜破裂及嵴斷裂減少，空泡樣變不明顯，但尚未能完全恢復到生理鹽水組的水平。空病毒組心肌細胞線粒體電鏡下結構改變與LPS/PepG 刺激組相似。見圖2。

表1 各組H9C2心肌細胞中UCP2 mRNA和蛋白表達水平及CK、TNF-α水平

GroupUCP2 mRNAUCP2 proteinCK [λB/(U·L-1)]TNF-α[ρB/(ng·L-1)]Normal control 1.05±0.050.25±0.023.17±0.054.23±0.13LPS/PepG 1.43±0.02?0.35±0.01?6.45±0.07?6.69±0.09?PHBLV 1.47±0.02?0.35±0.02?6.40±0.076.73±0.13?PHBLV-UCP2 1.94±0.01?△# 0.57±0.01?△#3.43±0.04△#5.30±0.27△#F466.571.81 328.9837.3P0.000.000.000.00

*P< 0.05 compared with normal control group；△P< 0.05 compared with LPS/PepG group;#P< 0.05 compared with PHBLV group.

A：Normal control group；B： LPS/PepG group；C: PHBLV group；D: PHBLV-UCP2 group.

2.4 各組H9C2心肌細胞中MMP水平 激光共聚焦顯微鏡定性觀察：與正常對照組比較，LPS/PepG刺激組、空病毒組和過表達組心肌細胞中紅色熒光(JC-1聚合體)/綠色熒光(JC-1單體)明顯下降；與LPS/PepG 刺激組和空病毒組比較，過表達組心肌細胞中紅色熒光(JC-1聚合體)/綠色熒光(JC-1單體)明顯上升。陽性對照組幾乎不見紅色熒光。見圖3(插頁一)。與正常對照組比較，LPS/PepG 刺激組和空病毒組心肌細胞中MMP水平明顯降低(P< 0.05)；過表達組心肌細胞中MMP水平明顯高于LPS/PepG 刺激組和空病毒組(P< 0.05)，但仍然低于正常對照組(P< 0.05)；與LPS/PepG 刺激組比較，空病毒組心肌細胞MMP水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.5 各組H9C2心肌細胞中線粒體ROS和ATP水平 與正常對照組比較，LPS/PepG 刺激組和空病毒組心肌細胞中線粒體ROS水平明顯升高(P<0.05)，ATP水平明顯降低(P<0.05)；與LPS/PepG 刺激組和空病毒組比較，過表達組心肌細胞中線粒體ROS水平明顯減低(P<0.05)，ATP水平明顯升高(P<0.05)。與LPS/PepG組比較，空病毒組心肌細胞線粒體ROS和ATP水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組H9C2心肌細胞中MMP和線粒體ROS及ATP水平

GroupMMPROSATP[mB/(μmol·g-1)]Normal control 0.424±0.0061.00±0.146.19±0.07LPS/PepG 0.213±0.005?2.53±0.03?2.65±0.05?PHBLV0.206±0.006?2.49±0.04?2.55±0.12?PHBLV-UCP2 0.399±0.007?△#1.73±0.06△# 4.54±0.08△#F567.8183.81 322.6P0.000.000.00

*P< 0.05 compared with normal control group；△P< 0.05 compared with LPS/PepG group；#P< 0.05 compared with PHBLV group.

3 討 論

膿毒癥是感染誘導機體調節(jié)失衡所致的危及生命的器官功能不全，嚴重膿毒癥是指膿毒癥并發(fā)器官功能不全或組織低灌注。Hartman等[7]回顧性研究發(fā)現(xiàn):2005年新生兒嚴重膿毒癥的發(fā)病率較1995年升高了1倍。膿毒癥誘導的心肌功能損害(SIMD)是嚴重膿毒癥的常見并發(fā)癥，其機制十分復雜[8]。

膿毒癥的動物模型比較成熟，細胞模型目前缺乏統(tǒng)一的標準[9-11]。本研究采用來自金黃色葡萄球菌細胞壁上的PepG與來自革蘭陰性菌LPS組成混合劑，刺激H9C2心肌細胞后，檢測到培養(yǎng)液中的CK及TNF-α水平明顯升高，提示膿毒癥的細胞模型構建成功；LPS/PepG刺激H9C2心肌細胞后，CK及TNF-α水平升高，提示LPS/PepG損害了心肌細胞,同時啟動了炎癥通路；增加UCP2在心肌細胞中的表達后，CK及TNF-α水平明顯降低，提示UCP2對膿毒癥心肌線粒體起保護作用，其具體機制可能與UCP2調節(jié)MMP有關。

心肌細胞富含線粒體，可提供大量ATP，同時也是大量產(chǎn)生ROS的場所。本研究顯示：UCP2過表達可以抑制心肌線粒體ROS的過多生成，這可能與MMP趨向正常狀態(tài)有關。Kizaki等[12]和Blanc等[13]通過巨噬細胞轉染UCP2 cDNA后發(fā)現(xiàn)：巨噬細胞產(chǎn)生的ROS量減少,而血細胞中缺乏UCP2會導致ROS合成增多，導致動脈粥樣硬化的惡化，與本實驗結果相似。Nègre-Salvayre等[14]研究發(fā)現(xiàn)：在肝、脾及胸腺中，GDP(UCP2解偶聯(lián)特效抑制劑)可以升高膜電位并引起ROS產(chǎn)生增多。上述實驗結果提示：UCP2可以調控ROS的合成，但其具體機制目前尚不完全清楚。

線粒體ATP水平是線粒體功能的重要指標。本研究結果顯示：膿毒癥時UCP2表達被抑制，MMP破壞，O2利用障礙，導致ATP合成明顯減少。通過慢病毒介導UCP2過表達后，線粒體ATP水平明顯回升，趨近正常水平，提示UCP2對于維持線粒體ATP水平有益。可能與UCP2通過解偶聯(lián)作用減少ROS合成有關。但UCP2與線粒體ATP合成之間的關系，目前爭論較多[15-16]，實驗結果也不盡相同[17]，其機制可能與線粒體的結構有關。

本實驗電鏡檢測結果顯示：LPS/PepG混合劑可導致心肌細胞線粒體形態(tài)結構破壞，表現(xiàn)為線粒體的邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質密度降低，部分線粒體內膜破裂、嵴疏松溶解，甚至出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，可見空泡樣變。Welty-Wolf等[18]在狒狒膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)：注入大腸埃希菌后12 h，狒狒的骨骼肌線粒體就出現(xiàn)線粒體嵴模糊，基質空泡化和內膜斷裂，提示膿毒癥導致線粒體結構的改變。Vanhorebeek等[19]在探討胰島素對膿毒癥患者線粒體的保護中發(fā)現(xiàn)：死于膿毒癥的20例ICU患者肝臟和肌肉組織的線粒體均明顯的腫脹、基質密度降低，部分線粒體內膜破裂，并且線粒體結構的損害與呼吸鏈復合體功能有關聯(lián)。此外，在實驗動物[20]和膿毒癥患者[21]心肌細胞中也有類似發(fā)現(xiàn)。本研究通過慢病毒促使UCP2過表達后，線粒體的形態(tài)結構明顯改善，其機制可能與ROS及MMP有關。

UCPs可降低線粒體外膜的質子勢能，從而穩(wěn)定MMP。UCP2可以通過解耦聯(lián)作用，開放離子通道，H+不通過ATP合成酶直接從線粒體內膜滲漏到線粒體基質中，從而起到調控膜電位的作用，同時不合成ATP。本研究結果顯示： 膿毒癥導致心肌細胞MMP明顯下降，與本課題組前期研究結果一致[6]；UCP2過表達后，MMP接近正常水平，表明UCP2可促進膿毒癥導致的MMP破壞的恢復，與傳統(tǒng)的UCP2解偶聯(lián)作用不一致，其中準確機制尚不明確。綜合前期研究及其他學者[22-23]的研究結果，本文作者認為：UCP2通過解偶聯(lián)作用調控MMP。此外，線粒體的形態(tài)結果和MMP也可能與線粒體內鈣濃度及線粒體通透性膜轉換孔的狀態(tài)[24]等有關，但本實驗未對上述指標進行檢測。

綜上所述，UCP2過表達可以抑制膿毒癥所導致的大鼠心肌細胞的損害及炎癥因子的釋放，同時膿毒癥所致的線粒體形態(tài)及功能的損害，可被UCP2過表達所逆轉或減輕。UCP2過表達對心肌細胞線粒體的保護作用機制可能是UCP2通過解偶聯(lián)作用調控心肌細胞MMP，減少ROS過多生成，維持線粒體的ATP合成，從而起到保護線粒體形態(tài)結構及功能的作用。