肺炎支原體快速培養法與抗原量子點免疫層析法快速檢測技術在支原體肺炎診斷中的應用

王貴萍

(深圳市羅湖區中醫院檢驗科，廣東 深圳 518001)

支原體肺炎(MP)是一種臨床上小兒呼吸道感染常見病原體，以呼吸道傳染最為多見，一旦感染，會對全身各臟器造成損傷。診斷MP常采用冷凝集素及血清特異性抗體檢測，但受到各種因素制約，其效果不佳[1]。近年來發展的抗原量子點免疫層析法快速檢測技術及MP快速培養法均具有快速、靈敏度高優點[2-3]。為了客觀評價此兩種診斷方法，深圳市羅湖區中醫院以80例MP病人作為研究對象，探討肺炎支原體快速培養法與抗原量子點免疫層析法快速檢測技術在支原體肺炎診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次80例支原體肺炎病人均為本院2015年6月至2016年6月所收治，其中男48例，女32例，年齡5個月～14歲，平均(4.27±0.42)歲。

1.2 方法

快速培養法：于清晨采集咽試子標本，快速置于培養基中，培養基購自武漢菁華時間科技公司，在瓶中攪動，靠緊瓶壁擠去多余殘液，隨后去除咽試子多余部分，蓋上瓶蓋后，將培養瓶放于37 ℃孵箱中，待6 h后觀察實驗結果。結果判斷：培養基顏色若由紅色變為黃色，視為陽性。

抗原量子點免疫層析法快速檢測技術檢測：1)主要試劑：粘性PVC底板(Whatman)；硝酸纖維素膜(Millipore M180，批號R3EA25725)；吸水紙(Whatman，型號CF6，批號B202AD0274)；1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)(偶聯劑，Sigma公司E7750)；玻璃纖維膜(Whatman，型號Accuflow G，批號13537975)；選用北京義翹神州生物科技有限公司制造的肺炎支原體多克隆抗體(兔抗人Mp多抗，濃度3 mg·mL-1)；選用北京博生福生物技術有限責任公司制造的Mp重組抗原(分子量30 KD，濃度6.8 mg·mL-1)。肺炎支原體單克隆抗體2株(1#和2#，針對Mp P1蛋白抗原)；選用上海熹垣生物科技有限公司制造的巰基丁二酸(規格：500 g；型號：XY-201-01055)；選用上海榕柏生物技術有限公司制造的N-羥基琥珀酰亞胺(規格：500 g；型號：K-1305)；選用上海鈺博生物科技有限公司制造的核殼型硒化鎘(規格：g·mg-1；型號：YBC119246)量子點，發射波長為625 nm；采用南京比迪生物科技有限公司制造的羊抗兔球蛋白抗體(規格：mg；型號BD-B02029)。2)儀器設備：選則北京富眾科技發展有限公司制造的大平面三維平臺HM3230噴膜儀，切條儀采用Bio-dot公司制造。3)a. NC膜的包被：C線選則方法為將二抗進行稀釋，一直稀釋到適宜濃度后噴膜，T線選則方法為對Mp單抗進行稀釋，一直稀釋到適宜濃度后噴膜，隨后將膜進行干燥。b.量子點的偶聯：將1 mL巰基丁二酸加入25 μL QDs展開離心洗滌30 min，轉速為18 000 r·min-1，去除上清液，再次洗滌一次；將一定量的碳二亞胺加入巰基丁二酸進行30 min活化，轉速18 000 r·min-1，洗滌兩次，每次均需去除上清液。之后將二抗加入其中并室溫孵育，待2 h后，將10%牛血清白蛋白加入其中，封閉30 min后展開離心，離心方式同上；最后加入25 μL保存液進行保存。4)量子點的噴膜：取10 μLQDs，此QDs必須偶聯有抗體，稀釋LQDs至適合濃度，調整噴膜機噴量至10 μL·cm-1，噴于玻璃纖維素膜，將玻璃纖維素膜置于37 ℃下干燥2 h。5)試紙條的制備：于粘性PVC底板上依次搭接量子點結合物墊、吸水紙以及NC膜，需要注意的是各個材料搭接時應相互重疊2 mm。搭接好后切割成3.5 mm寬的試紙條。6)試紙條檢測方法和結果判定：吸取50 μL梯度稀釋的重組抗原置于試紙條末端，3 min后將試紙條置于紫外燈下目測結果，T帶熒光帶在C帶顯示紅色熒光帶。取咽部拭子，加入1 mL洗脫液充分攪勻，再使用上述方法進行檢測和判斷。

1.3 觀察指標

比較兩種檢測方法的陽性率、靈敏度、特異度。

1.4 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行分析。計數資料的比較采用χ2檢驗，計量資料的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

快速培養法與免疫層析法陽性率、靈敏度、特異度比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩種檢測陽性率、靈敏度、特異度對比

3 討論

MP感染在近幾年引發呼吸道疾病的發生率上呈不斷上升趨勢，此類感染好發于兒童，傳播途徑為健康人群吸入或接觸到MP患者排出的分泌物，由于兒童抵抗力較弱，發生率較高[4-5]。其臨床表現復雜多樣，且病情程度輕重不等，易反復，病程長，還會并發肺外并發癥，對患者生活質量產生嚴重影響[6]。

肺炎支原體是一種對人有明顯致病性的病原體，它能引起原發性非典型肺炎即臨床所說的MP，是一種沒有細胞壁，專性細胞內寄生能在人工培養基上生長的介于病毒和細菌之間的病原微生物，生長緩慢，需23周以上。MP所致的呼吸道感染體征與常見的病毒感染、細菌極為相似，臨床鑒別難度較大；支原體結構獨特，其致病機理復雜，常規治療難以收效，感染發病后若得不到及時的診治容易誘發多種并發癥；臨床上對肺炎支原體感染的診斷要求是要做到快速、準確，而現有的檢測方法不能保證這方面的要求，建立一種快速、準確、簡便的檢測方法是目前臨床醫患雙方的迫切要求。臨床上對支原體肺炎病人通常采用冷凝集素及血清特異性抗體檢測，此種檢測方法雖然有一定效果，因其兩種方法易受到外界因素影響，檢測效果不佳[7]。查琳等[8]研究表明，早期進行MP檢查，對及時診斷及指導臨床用藥極其重要。本研究表明，在靈敏度及特異度上，兩組檢測方法相比，抗原量子點免疫層析法顯著高(P<0.05)，在陽性率上差異無統計學意義(P>0.05)。

隨著現今科學技術的發展，醫療水平不斷提升，當前微生物檢測技術不斷突破，主要是由于微生物快速培養新技術的不斷應用。尤其是病原體的檢測是當今醫學研究領域公認的發展方向和必經的步驟。Mp具有散在性、區域性流行的特點，利用Mp快檢試劑在流行期可迅速查找、隔離病原體，因此開展肺炎支原體快速檢測對Mp感染的早期診治，積極預防，合理選擇使用抗生素對保護患者身心健康，防止誘發其他并發癥極為重要。快速培養法是一種可以直接檢測MP病原體的實驗室方法，具有快速、簡便、敏感優點，能在發病初期檢測到MP，原因在于其培養液中含有快速生長因子和高營養成分，致使標本中病原體快速增殖，在12 h得出結果。由于MP特異性抗體受檢測時機的限制對MP感染的早期診斷價值有限，選擇Mp快速培養法12 h得出結果作為早期檢測，有助于臨床醫師實踐支原體肺炎臨床路徑，規范治療，減少成本，對臨床診斷具有重要意義。利用傳統培養方法改進其各種性能，推出MP快速培養試劑，加強MP檢測的特異性、靈敏度，使疾病的診斷更加準確、快速簡便。缺點在于特異性不是很高，在本研究中特異度僅為72.5%。

目前量子點免疫層析技術是臨床上研究的熱點，20世紀初誕生的量子物理學使世界發生了天翻地覆的變化，量子物理學不但影響到化學、物理學，而且波及到傳統醫學領域，大約在1950年左右，國外開始將量子理論應用到醫學領域。在20世紀80年代末，美國開始將量子醫學用于臨床診斷，之后迅速在日本、德國、韓國等國家得到發展。我國對量子醫學的研究始于20世紀90年代末，在國內尚屬方

興未艾的新型醫學。量子醫學是當今最先進的檢查科技。在本文中采用NHS交聯劑與EDC共價鍵連接，對兔抗人MP多克隆抗體進行量子點標記，由于EDC與量子點中的羧基反應得到酰基異脲，酰基異脲再與NHS反應生成NHS酯，最終于MP多抗中的氨基反應生成酰胺，從而與MP多抗進行偶聯。該反應體系還有以下特點：1)能夠避免與其他呼吸道常見菌交叉反應，特異性高。2)能在早期診斷，可直接檢測人咽拭子Mp抗原。3)檢測時間短，僅需3 min。

綜上所述，雖然在陽性率上兩種檢測無顯著差異，但量子點免疫層析技術優勢更多，靈敏度及特異度更高。