復凝聚法制備藥物微膠囊及細胞毒性評價

方 芳， 周 峻， 湯谷平

(浙江大學 化學實驗教學中心，杭州 310058)

0 引 言

如何延長藥物的釋藥時間和藥效持續時間成為制藥應用研究的關鍵問題[1]。而微膠囊化可以改善被包埋物質的物理性質，提高其穩定性，具有控制藥物釋放速度、保護芯材活性成分免受環境影響[2]，改善被包埋物質的反應活性、耐久性、壓敏性、熱敏性和光敏性，屏蔽氣味、降低物質毒性等[3]。微膠囊是指用高分子材料把分散的固態、液態或氣態物質包埋成微小封閉容器，微膠囊的粒徑通常在2～1 000 μm[4-5]，其外形一般呈球形[6]。

本文以卡培他濱為芯材，明膠、阿拉伯膠為壁材，采用復凝聚法制備微膠囊，通過研究各工藝參數對微膠囊制備的影響，確定最佳制備條件，并通過四氮唑藍比色實驗(MTT法)比較藥物和微膠囊的細胞毒性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：明膠，阿拉伯膠,甲醛，醋酸，氫氧化鈉，卡培他濱，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT，5 mg/mL)，二甲基亞砜(DMSO)，以上試劑均為分析純；DMEN培養液，新生小牛血清，以上試劑為生物試劑，用于細胞培養，所有試劑均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司購置的。

儀器：ECLIPSE Ti倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，UH5300紫外分光光度計(日本HITACHI)，Mastersizer 2000粒徑分布儀(英國Malvern)，BCTB S25 BASIC磁力攪拌器(德國IKA)，MIKRO22R高速離心機(德國Hetich)，371型二氧化碳培養箱(美國Thermo)，BIO-RAD 680酶標儀(美國Thermo，配570 nm濾光片)，MS3微量振蕩器(德國IKA)，JB-CJ-2FXS超凈工作臺(蘇州佳寶)。

1.2 微膠囊的制備

取一定量的阿拉伯膠水溶液(5%,重量體積比)和一定量的藥物，置于恒定的水浴中，磁力攪拌1 h后加入一定量的明膠溶液(5%,重量體積比)，繼續攪拌1.5 h。用醋酸調pH至4.2左右，繼續攪拌1.5 h。攪拌結束后，將上述溶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入1 mL甲醛溶液，進行微膠囊的固化，滴加結束后繼續常溫攪拌1.5 h。離心分離后，沉淀即微膠囊，用蒸餾水分散后用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.3 微膠囊形態學鑒定

取成囊后的溶液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片后在倒置熒光顯微鏡下觀察其外部形貌。

1.4 微膠囊包封率的測定

(1) 測定波長的選擇。取卡培他濱標準液，以蒸餾水作參比，用紫外分光光度計對其進行波長掃描，最終定為304 nm。

(2) 標準曲線方程的制定。準確稱取卡培他濱10 mg，用蒸餾水定溶至100 mL，配成0.1 mg/mL的溶液。移取0.1 mg/mL卡培他濱溶液10 mL，定容至100 mL，作為配置標準曲線的標準液。分別移取上述溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL定容至50mL，以蒸餾水為參比，用紫外分光光度計測定其在304 nm處的吸光度，作標準曲線，得回歸方程。

(3) 包封率的測定。將離心分離后的上清液用紫外分光光度法進行測量，確定未被包埋的卡培他濱的藥量，

1.5 微膠囊粒徑分布的測定

在不同的攪拌速度下制得的藥物膠囊，用粒徑分布儀對膠囊的粒徑分布進行測量。使用去離子水將微膠囊制成懸浮液在激光粒度儀上進行測試。

1.6 細胞毒性實驗

將C6細胞接種于96孔板內，每孔1×104個細胞，在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育16 h。

配制不同濃度的含有卡培他濱母液和無血清培養液的混合溶液，總體積均700 μL，濃度梯度為12.5、25、50、100、125 μg/mL。將混合溶液加入到培養板的孔中(加之前吸去原有培養液)，每孔液體的總體積在200 μL(注意每種濃度都為三復孔，另外需要0%MTT溶液三復孔)。孵育4 h后，吸去溶液，每孔加入90 μL無血清培養液和10 μL的5 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育2～3 h。翻板法棄去液體，每孔加入100 μLDMSO，在震蕩器上震蕩10 min。在酶標儀上用570 nm波長測吸光度(OD)值。細胞活力的計算式：

向離心后的微球加入1 mL去離子水混合均勻制成微球制劑，然后分別制成12.5、25、50、100、125 μg/mL溶液。加無血清培養液制成總體積為700 μL的制劑溶液，按上述方法進行MTT實驗。

2 結果與討論

2.1 芯壁比的確定

芯材與壁材的比例(芯壁比)能夠顯著影響所形成微膠囊的粒徑大小和形態特征[14]。圖1是不同芯壁比時制備的卡培他濱微膠囊的倒置熒光顯微鏡外部形貌。

(a) 芯壁比=1.0∶1.0

(b) 芯壁比=1.00∶1.25

(c) 芯壁比=1.0∶1.5

從圖1可以看出，隨著芯壁比的減少，微膠囊平均粒徑逐漸增大。這是由于在微膠囊形成的過程中，提高壁材(阿拉伯膠和明膠)用量可以增加囊壁的厚度，導致粒徑增大，同時有利于改善微膠囊對芯材的保護性和緩釋性，為此確定的最佳芯壁比微1.0∶1.5。

2.2 pH值

復凝聚的pH值對微膠囊的形成有著重要的影響，本研究通過改變pH值觀察微膠囊形成的現象，討論pH值對微膠囊制備的影響。pH值為4.0時，固化后有少量微膠囊形成，離心后分層不明顯；pH值為4.2時，固化后靜置，有較多微膠囊形成，離心后分層明顯；pH值為4.5時，固化后溶液透明，離心后不分層，基本無微膠囊形成，具體對比見圖2，由此確定最佳pH值為4.2。

pH 4.0pH 4.2pH 4.5

圖2 不同pH值條件下制得的微膠囊形態對比

2.3 溫 度

在保持其他條件不變的情況下，研究溫度對微膠囊制備的影響，具體結果見圖3。由于低溫下明膠和阿拉伯膠的混合溶液黏度較大，成膜的反應可能不夠充分，不利于復凝聚的發生，而隨著復凝聚溫度的提高，明膠和阿拉伯膠的混合黏度降低，有助于提高帶電荷電解質的流動性，兩者之間的復凝聚反應會更充分。但溫度過高，明膠蛋白質易于水解，并且產物的分子運

圖3 復凝聚溫度與包封率的關系

動加快，使得明膠和阿拉伯膠不能聚集在藥物表面形成囊體，導致芯材包封率過低。由此可得，合理的復凝聚溫度為55 ℃。

2.4 攪拌速度

在不同的攪拌速度下，制備的微膠囊粒徑用粒徑分布儀進行測量，結果見圖4。從圖中可知，當攪拌速率為800 r/min時，微膠囊的粒徑d0.5為14.38 μm；攪拌速率為1 200 r/min時，微膠囊的粒徑d0.5為7.38 μm；攪拌速率為1 600 r/min時，微膠囊的粒徑d0.5為2.45 μm。由此可見，隨著攪拌速率的增加，微膠囊的粒徑隨之變小。

圖4 不同攪拌速率下微膠囊的粒徑分布圖

2.5 細胞毒性實驗

圖5是MTT實驗結果，由實驗結果可知，在與細胞作用相同時間下，藥物對細胞的毒性更大，說明微膠囊對細胞具有緩釋的潛能。因為微膠囊通過囊壁對囊芯物進行包裹，既可以實現有效成分的保護及緩慢釋放[15]，降低了藥物的毒性。

圖5 藥物濃度與細胞存活率關系圖

3 結 語

實驗采用復凝聚法制備微膠囊，以卡培他濱為芯材，明膠、阿拉伯膠為壁材，通過對不同工藝條件的研究，得出其最佳制備條件為：芯壁比1.0∶1.5，復凝聚溫度為55 ℃，pH 4.2，攪拌速率為1 600 r/min。通過對比藥物和微膠囊的細胞毒性實驗可知，微膠囊化對藥物具有緩釋作用，可以提高藥物的藥效。該實驗設備簡單，操作容易，具有一定的創新性和實用性，易于鍛煉學生的科研能力。