松嫩草地豆類草群落土壤細菌碳源利用研究

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(1. 吉林農業大學，吉林 長春130118；2. 黑龍江八一農墾大學，黑龍江 密山 163319； 3. 東北師范大學植被生態科學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024)

草原生態系統中，植物是物質循環和能量流動的中樞，土壤細菌則是生物地球化學循環的重要驅動者，植物與土壤細菌之間的聯系較為復雜，植物可以通過改變土壤的物理化學條件對細菌群落的代謝活性和代謝多樣性產生一定影響，土壤細菌可以迅速響應并適應周圍環境的變化，調節植物生長以及植物營養元素活性等方面[1-3]。而在一定條件下，土壤細菌的多樣性則可以反映出土壤環境的歷史情況，在草地生態系統中具有重要作用[4-6]。

豆科植物在草地生態系統中具有重要生態功能，在改良土壤的結構、提高土壤的肥力和促進植被演替等方面具有一定的功能作用[7-8]。土壤細菌群落多樣性與生態系統營養之間密切相關[9]。有研究表明，豆科植物在一定程度上可以改善土壤細菌的功能，提高其群落的代謝多樣性[1,10]。

通過Biolog-ECO微平板培養技術可描述土壤細菌功能多樣性與代謝活性，從土壤細菌對單一碳源的利用程度來進一步反映土壤細菌群落水平的生理輪廓[11-13]。我們曾對松嫩草地羊草群落土壤細菌碳源利用進行了研究，關于豆類草群落與土壤細菌多樣性關系的研究還很少[14]。本試驗以鹽堿化嚴重，且羊草占主要優勢的松嫩放牧草地為背景，探討了草木犀和胡枝子兩種豆類草群落對土壤細菌碳源利用的影響，同時與羊草群落進行了比較。研究了不同植物群落與土壤細菌之間的關系，為草地可持續發展道路提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗小區概況

試驗地點為位于松嫩草地的西南部的東北師范大學草地生態研究站(35°23.1′～35°34.1′ N，123°30′20.5″～123°30′45.0″ E)。羊草(Leymuschinensis)和雜類草群落為草地的主要群落類型，這類群落主要分布于土壤堿化比較嚴重的地段。除優勢種羊草外，還有亞優勢種蘆葦(Phragmitisaustralis)，及其他伴生種如虎尾草(Chlorisvirgata)、拂子茅 (Calamagrostisepigeios)等，在植物群落間形成鑲嵌分布的格局，間有興安胡枝子(Melilotusdaurica)和草木犀(Melilotusofficinalis)等組成豆類草群落分布[15]。

1.2 試驗方法

1.2.1植被調查 植被調查于2014年8月牧草生長最為旺盛時期進行。樣地大小為1 m×1 m，重復3次。分別記錄植物種類、高度、蓋度、密度以及生物量等數據。

1.2.2土壤樣品采集 在試驗小區內按照羊草、草木犀和胡枝子群落取樣，采取“五點混合法”取土壤樣品，三次重復。土鉆直徑為2 cm，取地面下0～20 cm土壤。除去土樣中雜質，5 點混勻后將樣品裝入無菌塑料袋中，分為2份帶回實驗室。一份置于-20℃冰箱保存，用于進行Biolog實驗；另一份在室內進行風干，用于測定土壤理化性質。

1.2.3土壤理化性質的測定 烘干稱重法測定土壤含水量；用雷磁PHS-3C pH計測定土壤pH ；用DDS-307電導儀測定土壤電導率；凱氏定氮法測定土壤氮含量；重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質。

1.2.4Biolog-ECO微平板培養 將10 g過2 mm篩的土壤加到90 ml無菌NaCl溶液中，用振蕩器混勻(5 min，180 r·min-1)，按照10倍稀釋法配制成10-3倍土壤稀釋液，然后用移液槍注入到ECO微平板中，最后在26℃的培養箱中連續培養10 d，每隔12 h用Biolog儀讀數一次。

1.3 數據分析

數據分析軟件為Microsoft Excel 2007；方差分析軟件為SPSS 17.0；冗余分析(RDA分析)軟件為Canoco for Windows 4.5。

土壤細菌代謝強度采用單孔顏色平均值(average well color development，AWCD)來描述。

計算方法為：AWCD=∑(C590-C750)/31

式中： C590為生態板中碳源孔在590 nm下的吸光度值減對照孔，C750為碳源孔在750 nm下的吸光度值減對照孔。

采用Shannon-Wiener指數、Pielou均勻度指數以及Gini多樣性指數來描述土壤細菌群落的多樣性：

(1)Shannon-Wiener指數(H)：H = -Σ(Pi×lnPi)

(2)Pielou均勻度指數(E)：EH = H/Hmax = H/lnS

(3)Gini多樣性指數(D)：D = 1 - ΣPi2；

式中：Pi= C590-C750/∑(C590-C750)，S 為 ECO 板中顏色變化孔的數目。

2 結果與分析

2.1 植物群落特征

植物群落中植物組成變化對植物群落特征影響較大，各項指標均存在顯著差異(P<0.05)。羊草群落主要由羊草、蘆葦、虎尾草、紫花苜蓿(Medicagosativa)等植物組成；草木犀群落主要由草木犀、羊草、蘆葦和堿地膚(Kochiasieversiana)等植物組成；胡枝子群落主要由興安胡枝子、羊草、廣布野豌豆(Viciacracca)和全葉馬蘭(Kalimerisintegrifolia)等植物組成。胡枝子群落植被高度最高，其次為羊草群落，最后為草木犀群落；草木犀群落和胡枝子群落在植被蓋度、密度和地上生物量上均小于羊草群落，且二者之間差異不顯著(見表1)。

表1 植物群落特征Table 1 Characteristic of plant community

注：同列不同字母表示差異顯著(P< 0.05)，數據為平均值±標準誤，下同

Note: Values with different lowercase letters show significant differences at the 0.05 level, the data is average value ± standard error. The same as below

2.2 土壤理化性質

3種植物群落的土壤理化指標均存在顯著差異(P< 0.05)。其中，羊草群落的含水量、電導率和pH均最高；而草木犀和興安胡枝子群落的有機質和全氮含量則明顯高于羊草群落(見表2)。

表2 土壤理化性質Table 2 Physicochemical properties of soil

2.3 土壤細菌的平均吸光度值

結果表明，3種植物群落土壤細菌的AWCD值均隨培養時間的延長而上升(見圖1)。培養前36 h，3種植物群落土壤細菌的AWCD值變化不明顯；96～180 h之間土壤細菌的代謝活性增加，消耗碳源的速度加快；180 h后，平緩增長，代謝功能下降。興安胡枝子群落土壤細菌的AWCD值上升較快，且增長幅度明顯高于羊草和草木犀群落；而羊草群落和草木犀群落則上升較為緩慢且增長情況相近。興安胡枝子群落土壤細菌的AWCD值最高，說明其土壤細菌對碳源利用情況最好。而草木犀群落的AWCD值與羊草群落接近，但稍低于羊草群落，說明二者的土壤細菌代謝情況與活性接近。

圖1 土壤細菌平均吸光值變化曲線Fig.1 Curve of AWCD of soil bacteria

2.4 土壤細菌生理碳代謝指紋圖譜分析

從Biolog代謝指紋圖譜可以更加直接和全面地了解土壤細菌群落代謝功能。結果表明，松嫩草地羊草群落土壤碳源利用的數量最少，對L-天門冬酰胺、D-甘露醇和吐溫等4種碳源的利用程度最好，對2-羥基苯甲酸和衣康酸等8種碳源幾乎沒有利用；草木犀群落土壤碳源利用的情況好于羊草群落，對D-甘露醇、D-纖維二糖和L-絲氨酸等8種碳源的利用程度較好，對D, L-α-磷酸甘油等4種碳源幾乎沒有利用；胡枝子群落土壤碳源利用數量最多，大多數碳源利用情況較好，只對γ-羥丁酸、α-環式糊精和苯乙胺這3種碳源幾乎沒有利用(見圖2)。

圖2 土壤細菌生理碳代謝指紋圖譜Fig.2 Metabolic fingerprint of carbon physiological profiles of soil bacteria注：G1-B3為糖類，包括G1.D-纖維二糖；H1.a-D-乳糖；A2.β-甲基-D-葡萄糖苷；B2.D-木糖；C2.I-赤藻糖醇；D2.D-甘露醇；E2.N-乙酰基-D-葡萄胺；F2.D-氨基葡萄糖酸；G2.α-D-葡萄糖-1-磷酸；H2.D,L-α-磷酸甘油；A3.D-半乳糖酸內脂；B3.D-半乳糖醛酸；A4-F4為氨基酸類，包括A4.L-精氨酸；B4.L-天門冬酰胺；C4.L-苯基丙氨酸；D4.L-絲氨酸；E4.L-蘇氨酸；F4.甘氨酰-L-谷氨酸； B1-H3為羧酸類，包括B1.丙酮酸甲酯；E3.γ-羥丁酸；F3.衣康酸；G3.α-丁酮酸；H3.D-蘋果酸；C1-F1為多聚物類，包括C1.吐溫；D1.吐溫80；E1.α-環式糊精；F1.肝糖；C3-D3為酚酸類，包括C3.2-羥基苯甲酸；D3.4-羥基苯甲酸；G4-H4為胺類，包括G4.苯乙胺；H4.腐胺

2.5 土壤細菌對不同碳源的利用

Biolog-ECO微平板的31種碳源分6類，分別是糖類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類和胺類。對180 h的AWCD值進行6類碳源利用分析，胡枝子群落對6類碳源的利用情況均高于其他兩種植物群落；羊草群落對糖類和氨基酸類利用較好，對酚酸類利用最差；草木犀群落對羧酸類利用最差；3種植物群落土壤細菌對氨基酸、糖類等的利用程度較好，對胺類的利用較差(見圖3)。

圖3 土壤細菌對六類碳源的利用情況Fig.3 AWCD change of the soil bacteria with 6 carbon sources

2.6 土壤細菌碳源利用多樣性指數

對180 h的AWCD值進行多樣性指數分析，不同植物群落下土壤細菌群落的碳源利用多樣性指數不同，胡枝子群落的Shannon-wiener指數，Pielou均勻度指數以及Gini多樣性指數最高，說明其多樣性與均勻度最好；草木犀群落的多樣性與均勻度最低(圖4)。

圖4 土壤細菌碳源利用多樣性指數Fig.4 Diversity index of carbon source metabolism of soil bacteria

2.7 土壤細菌碳源利用與土壤理化指標冗余分析

對180 h的AWCD值進行細菌碳源利用的RDA分析，可以看出不同植物群落土壤細菌碳源利用與土壤理化指標關系(見圖5)。各個樣方按照植物群落不同而呈有規律分布，碳源利用差異主要由植物群落決定。所有土壤變量可以解釋土壤細菌群落變化總變量的78.2%(蒙特卡羅置換檢驗999，P= 0.01)，第1軸作為約束軸能解釋環境變量的37.8%，綜合箭頭方向和長度分析，土壤的有機質和全氮含量是影響這3種植物群落土壤細菌碳源利用的最主要因素，而從這2種環境因素分析對3種植物群落對碳源利用情況大小排序依次為，胡枝子群落、草木犀群落和羊草群落。

圖5 土壤細菌31孔吸光度值與土壤理化性質冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of the 31 hole absorbance value of soil bacteria and physicochemical properties of soil(RDA)

3 討論

松嫩草地的優勢種羊草占的比例最多，也分布一些豆科植物和雜類草，但其中羊草的營養價值高、適口性良好等一系列特征導致在放牧過程中被消耗的最多[15-16]。經過短期放牧后，出現了胡枝子和草木犀為代表的2個主要豆科植物群落，在蓋度、密度以及地上生物量上均比羊草群落低，植物群落豐富程度略低，說明放牧改變了草地植物群落的組成。

豆科植物可以作為綠肥，提高土壤含氮量，且在植物生長發育過程中，細根及根瘤的死亡脫落，以及枯落物的腐解等，同樣使得土壤中有機質的含量升高[17]。3種植物群落的土壤理化指標同樣差異明顯，其中2種豆科植物群落土壤的有機質與全氮含量高于羊草群落。RDA分析表明，影響植物群落土壤細菌碳源利用的最主要因素為土壤的有機質含量及全氮含量。從中可以看出，豆科植物會對土壤條件有顯著的改善作用，從而進一步影響土壤細菌的碳源代謝情況。

Biolog-ECO微平板技術可以獲得大量數據和有價值的信息，是研究土壤細菌群落功能多樣性的簡單、有效的主要方法[18]。土壤細菌利用單一碳源的AWCD值均隨時間延長而上升，與土壤細菌的代謝情況呈相近的趨勢。Biolog-ECO微平板培養土壤細菌的整體培養時間通常為10 d，共240 h。0～24 h為土壤細菌適應微平板環境的滯后期；24 h后進入快速增長的指數期；通常在156～192 h之間會有一個拐點時間，使其進入生長的平緩期[19-20]。本試驗的3種植物群落土壤細菌的AWCD值隨時間變化曲線符合這一生長規律。

地上植物不同，土壤碳源種類和數量也可能不同，土壤中存在的代謝不同碳源的細菌在數量和分布上也不相同。Biolog-ECO生態板中，至少有9種碳源是根系分泌物的組分，因此不同植物群落的土壤細菌對碳源的利用程度存在差異[21-23]。胡枝子群落土壤細菌利用碳源的數量和種類最多，對糖類、氨基酸和多聚物這3類碳源能進行很好的利用，對胺類的利用率最低；羊草群落和草木犀群落土壤細菌利用的碳源數量較少，對碳源利用好的種類也較少。說明在胡枝子群落中，土壤中所含有的代謝不同碳源的細菌的類型和數量較多。

多樣性指數在反映土壤細菌的群落組成以及個體數量分布上有一定作用，通過土壤細菌群落的多樣性和均勻度，可以進一步反映土壤細菌群落的組成結構及其穩定程度[24-25]。胡枝子群落土壤細菌群落的多樣性指數最高，說明具有較高代謝活性細菌的種類和數量較多。已有研究表明，豆科植物可增加土壤微生物的數量和代謝多樣性[10]。在松嫩放牧草地中，豆科植物在改善草地植物格局、提高飼草產量和質量等方面具有重要的生態功能[16]。

4 結論

綜上所述，不同植物群落組成及其地下土壤理化指標導致了土壤細菌碳源利用的不同，不同植物群落土壤細菌群落功能多樣性有很大差異。豆類草群落下的植被蓋度、密度和地上生物量均小于羊草群落，但豆科植物的固氮作用導致有機質和全氮含量明顯增加，改善了土壤條件，使得土壤細菌碳源利用較好。2種豆科植物群落植物組成不同，對土壤碳源利用存在差異，反映了其土壤細菌代謝能力及活性不同。土壤的有機質和全氮含量是影響土壤細菌碳源利用的最主要因素。