桑椹花青素的提取及其與總黃酮的比較研究

崔京燕，楊靜，桑鑫燕，韓紅娟，劉淑珍，樊彥玲，劉永平，趙京帥

（中北大學化學工程與技術學院，山西太原030051）

桑椹（Fructus Mori，mulberry）為多年生木本植物桑樹（Morus alba L.）的成熟果穗，又名桑葚子、桑果、桑棗等。多數(shù)桑椹成熟期為5月～6月份，果實成熟后為紫紅色或紫黑色，呈長橢圓形，風味獨特。桑椹不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質等營養(yǎng)元素[1]，而且富含多種具有生物活性的小分子化合物，如黃酮和花青素，與沙棘、懸鉤子（樹莓）等一起被譽為藥食同源的“第三代水果”[2]。黃酮類化合物和花青素的基本母核結構見圖1。

圖1 黃酮類化合物和花青素的基本母核結構Fig.1 The basic structure of flavonoids and anthocyanins

黃酮類化合物（flavonoids）是植物中重要的次生代謝物之一，泛指兩個芳香環(huán)（A，B環(huán)），通過中央三碳橋相互連接而成的一系列化合物，基本骨架為C6-C3-C6（圖1a），根據(jù)三碳橋的氧化程度，黃酮類化合物可分為黃烷酮、黃酮醇、異黃酮、花青素等[3]?；ㄇ嗨兀╝nthocyanins）是一種廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，母核結構為2–苯基苯丙吡喃（圖1b），即花色苷元[4]?；ㄉ赵狟環(huán)各碳位上取代基的不同，使得花青素種類繁多。桑椹中富含的花青素種類主要為矢車菊-3-O-葡萄糖苷和矢車菊-3-O-蕓香糖苷[5]。研究表明，不僅矢車菊-3-O-葡萄糖苷可抑制大鼠主動脈血管平滑肌細胞腫瘤壞死因子遷移[6]；而且花青素粗提物也可以抑制肺癌細胞的入侵與擴散，具有較高的藥用價值[7]。桑椹總黃酮種類主要為槲皮素-3-蕓香糖苷（蘆?。㈤纹に?3-葡萄糖苷和槲皮素-3-丙二酰葡萄糖苷，而槲皮素-3-葡萄糖苷已經(jīng)被證明可通過誘導低密度脂蛋白受體抑制膽固醇增多[8]，預防心血管疾病，另外桑椹總黃酮粗提物也具有清除氧自由基，抗衰老的作用[9]。因此，桑椹中總黃酮與花青素的粗提物和單品具有消炎抗癌、抗衰老和降血壓等重要作用，在藥品、食品、化妝品等行業(yè)有著巨大的應用潛力。

然而，桑椹具有成熟期短且易腐難存的弊端，其營養(yǎng)價值和藥用價值均未得到充分開發(fā)利用，存在巨大的資源浪費問題。根據(jù)研究報道，桑椹成熟過程中總黃酮與花青素含量變化規(guī)律不同，花青素主要在全紅期至紫黑期的發(fā)育階段合成，而總黃酮在幼果期和成熟期各有一個合成高峰[10]。由于花青素屬于總黃酮類化合物的衍生物，二者的合成酶及產(chǎn)生途徑具有一定相關性[11]，可依據(jù)二者合成規(guī)律調控不同藥用成分含量，對不同階段桑椹進行不同成分的提取利用，為桑椹的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

所以，桑椹的集中采收，活性成分提取、分離和加工有助于更好地開發(fā)利用桑椹和桑樹資源。超聲輔助提取法由于快速、簡單、成本低、提取率高，且不依賴大型設備等優(yōu)點，是目前從植物細胞、果實、葉片等材料中提取天然產(chǎn)物最常用、有效的方法之一[12]。楊松[13]采用四元二次正交旋轉組合設計，研究影響超聲輔助提取藥桑果實花青素的主要因素是：乙醇濃度（52.46%～55.93%）、液料比[39.51 ∶1（mL/g）～42.43 ∶1（mL/g）]、超聲時間（27.77 min～32.23 min）、超聲溫度（50.18℃～52.4℃）。

本文以市售水果桑椹（果桑）為原料，采用響應面法優(yōu)化桑椹花青素的超聲輔助提取工藝。使用桑椹花青素最優(yōu)提取工藝并參考楊靜等[14]的方法分別對果桑、藥用桑椹干果（藥桑）、自植盛果期粉紅桑椹（粉桑）和紫黑桑椹（黑桑I）及自植敗果期紫黑桑椹（黑桑II）進行花青素和總黃酮提取，對不同品種、成熟期、顏色等桑椹中花青素與總黃酮進行提取和測定比較，為桑椹的采后分揀加工提供數(shù)據(jù)支持，有利于桑樹資源的綜合開發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

2017年5 月～7月間收集5類桑椹。（1）果桑：市售水果桑椹，水分含量約85%，中北大學森德超市；（2）藥桑：藥用桑椹干果，河北漢草堂藥業(yè)有限公司，收集于山東；（3）粉桑：晉桑1號，2017年5月采自中北大學實驗田，粉紅色桑椹（＞50%果實轉為粉紅色），水分含量約為 77%；（4）黑桑 I：晉桑 1號，2017年 6月中北大學實驗田，盛果期紫黑桑椹（＞50%果實轉為紫黑色），水分含量約 80%；（5）黑桑 II：晉桑 1 號，2017 年7月采自中北大學實驗田，敗果期紫黑桑椹（全樹果實＜10%，紫黑色），水分含量約73%。置于電熱鼓風干燥箱中，溫度60℃，烘干至室溫恒重。將烘干處理后的桑椹置于研缽中，研磨至均勻粉末狀，存放于常溫干燥處備用。

無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；YH-A3003電子天平：瑞安市英衡電器有限公司；PHS-3C數(shù)顯酸度計：杭州奧立龍儀器有限公司；JOYN-15AL超聲波清洗機：上海喬躍電子有限公司，40 KHz；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器制造廠；721E紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PCB-1500紫外可見光譜分辨儀：珀金埃爾默股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑椹的提取工藝流程

桑椹粉末浸泡于提取液→超聲輔助提取→離心（12 000 r/min，10 min）→取上清液即得桑椹提取液

1.2.2 桑椹花青素最大吸收波長的測定

取0.25 mL提取液于試管中，加入pH 1.0氯化鉀-鹽酸緩沖液（0.2 mol/L）9.75 mol/L，搖勻，避光平衡100 min[15-16]。以蒸餾水為空白，在200 nm～700 nm波長下進行全波段光譜掃描，確定桑椹花青素在可見光區(qū)的最大吸收波長。

1.2.3 pH示差法測定桑椹花青素提取率。

取0.25 mL和0.5 mL提取液，分別用pH 1.0氯化鉀–鹽酸緩沖液（0.2 mol/L）和pH 4.5乙酸鈉-鹽酸緩沖液（0.2 mol/L）定容至 10 mL，避光平衡 100 min[16-17]。以蒸餾水為空白，分別在最大吸收波長和700 nm處測定吸光度值。花青素提取率計算公式為：

式 中 ：A=（Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；MW（矢車菊-3-葡萄糖苷分子量）=449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；ε（摩爾消光系數(shù)）=26 900 L/mol·cm；L 為光程，cm；m 為樣品干重，g。

1.2.4 單因素試驗設計

以果桑為樣品，稱取（1±0.002）g樣品，以50%乙醇20 mL作提取液，pH值為2.0，在160 W、60℃超聲條件下提取30 min為工藝基礎，分別研究液料比（20∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1 mL/g）、提取液 pH（2、3、4、5、6）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、超聲時間（0、15、30、45、60 min）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）和超聲功率（0、100、150、200、250 W）6個單因素條件對桑椹花青素提取率的影響，重復3組。

1.2.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，確定影響桑椹花青素提取率較為顯著的因素，即液料比、提取液pH值、乙醇濃度和超聲時間，以桑椹花青素提取率為響應值，采用Box-Behnken模型優(yōu)化桑椹花青素的提取工藝條件，各因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平Table 1 Plackett-Burman experimental factor and level

1.2.6 不同品種桑椹中花青素和總黃酮的含量比較

根據(jù)響應面試驗得出的最優(yōu)提取工藝條件，對果桑、藥桑、黑桑I、黑桑II和粉桑進行花青素提取，并用pH示差法測定不同種桑椹中花青素的含量；根據(jù)楊靜等[14]對總黃酮的提取方法，?。?±0.002）g桑椹樣品，加入60%乙醇10 mL，采用超聲功率160 W、超聲溫度60℃、超聲時間30 min的提取條件，對各種類桑椹樣品進行總黃酮提取，并根據(jù)標準曲線回歸方程A=13.344C-0.001 1，計算各桑椹樣品中總黃酮的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0軟件進行響應面試驗設計及分析，利用SPSS 20.0軟件進行檢驗統(tǒng)計，其余運用Microsoft excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 桑椹花青素最大吸收波長的測定

對桑椹提取液進行紫外-可見全波段光譜掃描，桑椹花青素的光譜掃描圖見圖2。

圖2 桑椹花青素的光譜掃描圖Fig.2 UV-Vis absorption spectrum of mulberry anthocyanins

由圖2可見在280nm和514nm波長處分別有兩個強吸收峰，這與顏色較深的花色苷在紫外光區(qū)270 nm～280 nm和可見光區(qū)465 nm～550 nm（特別是520 nm左右）波長處分別有兩個特征吸收峰的報道相符[18]。由此確定桑椹提取液為花色苷成分，并且在可見光區(qū)的最大吸收波長為514 nm。

2.2 單因素試驗結果

各提取參數(shù)對桑椹花青素提取率的影響見圖3。

圖3 各提取參數(shù)對桑椹花青素提取率的影響Fig.3 Effects of different parameters on the extraction ratio of mulberry anthocyanins

在設定的單因素條件下，花青素提取率均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，其中，提取率最大值的對應條件分別為：液料比 50 ∶1（mL/g）（圖3a），提取液 pH 3.0（圖3b），乙醇濃度 70%（圖3c），超聲時間 30 min（圖3d），超聲溫度 60 ℃（圖3e），超聲功率 150 W（圖3f）。此外，不同單因素條件下，花青素提取率的最大值與最小值的比率分別為72.92%（液料比）、66.13%（提取液pH值）、87.65%（乙醇濃度）、68.18%（超聲時間）、24.14%（超聲溫度）、21.21%（超聲功率），即液料比、乙醇濃度、提取液pH值和提取時間對桑椹花青素的提取率影響較大，故而選取這4個因素進行進一步響應面試驗設計。

2.3 響應面法試驗設計及結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據(jù)Box-Behnken的統(tǒng)計設計原理，參考單因素試驗結果，固定超聲功率150 W、超聲溫度60℃，選擇液料比、提取液pH值、乙醇濃度和超聲時間，進行四因素三水平試驗設計，共3個中心點，27個試驗點，試驗結果見表2。

2.3.2 響應面法回歸方程及方差分析

采用Design-Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以各因素水平編碼為自變量，桑椹花青素提取率為響應值的二次回歸方程為：提取率（%）=1.79+0.13A-0.032B+0.24C+0.030D-0.36AB+0.067AC+0.055AD+0.28BC-0.052BD+0.083CD-0.44A2-0.28B2-0.33C2-0.63D2。

對該模型進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 The experiment design and results of RSM

表3 響應面二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

續(xù)表3 響應面二次回歸方程方差分析Continue table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

從方差分析結果（表3）可以看出：該模型的顯著水平為0.006 1（小于0.05），說明該回歸方差模型是顯著的。響應值與 A2、D2相關極顯著，與 C、AB、B2、C2相關顯著，該模型的相關系數(shù)R2為0.804 8，因變量與自變量之間線性關系顯著。說明該回歸方程對試驗擬合情況良好，可用模型代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

2.3.3 響應曲面圖分析

根據(jù)上述回歸方程繪制響應面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析各因素相互作用對花青素提取的影響，結果如圖4所示。

圖4 影響桑椹花青素提取率的各參數(shù)三維響應面圖Fig.4 Three-dimensional response surface analysis of factors influencing the extraction ratio of anthocyanins from mulberry

對比圖4（a）～（f）可知，桑椹花青素的提取率均隨提取條件值的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并且響應曲面的坡度越陡峭，說明交互作用越顯著。可以看出，圖4（a）的曲線最陡峭，圖4（b）～（f）的曲線均次之，故液料比和提取液pH值的交互作用最顯著，圖形分析結果與方差分析結果一致。

2.3.4 優(yōu)化與驗證

通過回歸模型分析，得出桑椹花青素的最佳提取工藝參數(shù)為液料比 51.75 ∶1（mL/g）、提取液 pH3.03、乙醇濃度74.03%、超聲時間30.84 min，預測花青素提取率最大值為1.84%?？紤]到實際操作的方便和可行性，將桑椹花青素的提取工藝調整為液料比50∶1（mL/g）、提取液pH 3.0、乙醇濃度75%、超聲時間30 min，進行3次重復試驗，得出桑椹花青素提取率為1.72%，比模型預測值略低6.52%，說明該模型是準確可行的。

2.4 不同品種桑椹中花青素與總黃酮含量測定結果

按照1.2.6的方法分別測定果桑、藥桑、粉桑、黑桑I和黑桑II中的花青素與總黃酮含量，經(jīng)SPSS軟件中Duncan法分析數(shù)據(jù)結果見圖5。

圖5 不同桑椹品種中總黃酮與花青素含量Fig.5 Total flavonoid and anthocyanin contents of selected mulberry varieties

在被檢測的桑椹花青素中，果桑和黑桑I含量最高（＞1.7%），其次是粉桑（0.86%）和黑桑 II（0.70%），最低是藥桑（0.53%）；黃酮含量則表現(xiàn)為果桑最高（2.40%），其次是黑桑I、粉桑和藥桑（0.8%～1.0%），最低是黑桑II（0.36%）。綜合考慮，本試驗中果桑品質最優(yōu)，黑桑II品質最差。桑椹品種、顏色、成熟期等均會影響其花青素及總黃酮含量。

3 討論

桑椹花青素和總黃酮都具有消炎、抗癌、降血壓和降血脂等作用[19]，關于它們的植物源粗提物、純化物和單品都是中西藥業(yè)、食品業(yè)及化妝品行業(yè)趨之若鶩的珍品。本研究由響應面模型優(yōu)化得出桑椹花青素的理論最佳工藝為液料比51.75∶1（g/mL）、提取液pH 3.03、乙醇濃度74.03%、超聲時間30.84 min，提取率為1.82%。馬義虔等[17]采用響應面Box-Behnken模型設計，得出超聲輔助提取桑椹中花青素的最佳條件為乙醇濃度60%，提取液pH2.0，超聲溫度53℃，超聲時間35 min，冷凝回流提取兩次得到花青素含量為259.50 mg/100 g；Dranca等[20]同樣采用響應面Box-Behnken模型設計，得出超聲輔助提取茄子皮中花青素的最佳條件為甲醇濃度54.4%，超聲頻率37 kHz，超聲溫度55.1℃，超聲時間44.85 min，花青素含量241.07 mg/100 g。本試驗中提取工藝的研究材料為市售桑椹，水分含量約85﹪，經(jīng)計算轉換，本試驗提取得到桑椹花青素的含量約為258 mg/100 g（鮮重）。因此，本研究得出桑椹花青素的最優(yōu)提取工藝條件及提取率與前人研究接近，且工藝流程更短更簡單。

在桑椹花青素優(yōu)化工藝的基礎上，參考楊靜等[14]的總黃酮測定方法，同期測定了果桑、藥桑、粉桑、黑桑I和黑桑II中的花青素與總黃酮含量，結果顯示果桑和黑桑I的花青素含量最高，而且果桑的總黃酮含量是黑桑I的3倍。據(jù)馮晨靜等[21]對草莓冷溫貯藏期間花青素與總黃酮含量變化規(guī)律的研究，冷藏條件下的草莓果實，花青素含量的增加趨勢比較平緩，而總黃酮含量在第1天下降后又開始大量上升。因此，推測果桑中總黃酮含量高的現(xiàn)象可能與果桑在售出前經(jīng)一定時間冷藏保存，而累積較多的總黃酮有關。藥桑花青素含量最低，可能是由于花青素性質不穩(wěn)定，在采后大規(guī)模干制處理過程中被大量破壞所致；而且，藥桑與其它的總黃酮含量相比也沒有什么優(yōu)勢。Wang等[22]對藥用植物黑桑果實、根、枝和葉的醇提物的研究結果顯示，它們的總黃酮含量相差不大，但是果實醇提物的抗氧化能力和與Fe2+的螯合能力最強，據(jù)此推測本試驗中藥桑的藥用成分可能不是以黃酮和花青素為主，可能還有其它成分。

粉桑、黑桑I和黑桑II代表了果實成熟過程中未成熟期、成熟期和成熟后期3個階段，花青素的變化呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。王振江等[10]對桑椹成熟過程中花青素變化規(guī)律的研究顯示，花青素主要在全紅期至紫黑期發(fā)育階段合成；Wang等[23]也發(fā)現(xiàn)草莓綠熟期及粉紅期的花青素含量極微，在紫紅成熟期花青素大量合成和積累。這與本試驗研究中粉桑和黑桑I的花青素含量隨果實成熟度、著色度增加而增加的關系一致。但是本試驗結果顯示粉桑和黑桑I的黃酮含量相同，是黑桑II的兩倍多。這與馮晨靜等[21]研究在草莓綠熟期總黃酮含量較高，隨著果實的成熟，含量逐漸下降的結果不符；而王振江等[10]發(fā)現(xiàn)桑椹成熟過程中黃酮在幼果期和成熟期各有一個合成高峰，故而推測粉桑（幼果期）和黑桑I（成熟期）黃酮含量相同正是由于二者均處于合成高峰。因此，關于桑椹果實中花青素與總黃酮的變化規(guī)律可能需要更細致更深入的研究。此外，黑桑II雖然顏色積累及外觀形態(tài)已達到成熟狀態(tài)，但其營養(yǎng)條件及生長環(huán)境等不利因素使其花青素含量和總黃酮含量均遠遠低于黑桑I，所以敗果期桑椹利用價值普遍較低，可考慮由其自由脫落、腐爛，為土地增加養(yǎng)分；而盛果期桑椹在不同成熟階段所含主要藥用成分不同，可考慮批量采摘后，針對不同成熟階段果實進行不同藥用成分的選擇性利用。這在經(jīng)濟育林、合理開發(fā)桑樹價值方面有著重大意義。

4 結論

本文以果桑為研究對象，優(yōu)化得出桑椹花青素的最佳提取工藝為液料比50∶1（mL/g）、提取液pH 3.0、乙醇濃度75%、超聲時間30 min，提取率為1.72%。

對果桑、藥桑、粉桑、黑桑I和黑桑II中的花青素與總黃酮含量進行提取和測定分析，結果顯示花青素含量最高是果桑和黑桑I，粉桑、黑桑II和藥桑次之；總黃酮含量最高的是果桑，其次是紫黑I、粉桑和藥桑，最差是黑桑II?？傮w來看，果桑最佳，黑桑II的花青素與總黃酮含量均最低，利用價值較小。本研究響應了前人關于漿果在不同成熟期、貯藏環(huán)境中花青素與總黃酮含量的變化關系，其中，花青素含量在盛果期隨果實成熟度及著色度的增加而增加，為桑椹的綜合開發(fā)利用及桑樹的進一步經(jīng)濟育林提供依據(jù)。