秋葵黃酮的純化和體外抗氧化活性研究

周婧琦，羅雙群，*，王晶晶，高愿軍

（1.漯河食品職業學院，河南漯河462300；2.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南鄭州450000）

黃秋葵是近年來在我國流行起來的一種高營養保健蔬菜，其果實口感柔滑，富含蛋白質和脂肪，可供炒、涼拌、煲湯，工業生產也可將其做成秋葵醬、罐頭、腌菜等風味產品[1]。國內外研究表明，秋葵還具有抗疲勞、抗氧化、提高人體免疫能力等保健功效[2-4]。

黃酮類物質是一類含有酚羥基的還原性物質，酚羥基結構可提供質子和電子，與自由基反應，生成半醌式自由基[5]，從而中斷自由基鏈式反應，不管是在生物體內或是體外均有很強的抗氧化性，秋葵具有的保健功效與其中所含有的黃酮類物質密切相關。為了從秋葵中提取純度較高的黃酮類物質，分離純化是關鍵步驟。目前黃酮類化合物的分離純化方法主要有樹脂吸附法、超濾法、層析法、金屬試劑絡合沉淀法等。而大孔吸附樹脂優勢突出，其吸附量大且被吸附物質易于洗脫，穩定性高，材料環保，可再生，能重復使用，但其在秋葵黃酮的分離純化鮮有報道[6]，因此利用大孔樹脂分離純化秋葵黃酮具有重要價值。本文利用4種大孔樹脂對秋葵黃酮進行分離純化，確定最優純化工藝條件，并通過體外抗氧化試驗，測定秋葵黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的清除能力，以期為天然抗氧化劑開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋葵：鄭州市緯三路蔬菜批發市場華玉蔬菜商行；大孔樹脂 AB-8、NKA-9、HPD-400、D4020：鄭州華溢科技新材股份有限公司；其余試劑均為分析純。

XY-FD-18真空冷凍干燥機：上海欣諭儀器有限公司；RRHP-100型萬能高速粉碎機：歐凱萊芙香港實業公司；SB-5200DT超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；WBFY-205微電腦微波化學反應器：鞏義市予華儀器有限責任公司；HH-S4數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫療器械廠；HC-3618R高速冷凍離心機：安徽中科科學儀器有限公司；752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；HL-2恒流泵：上海青浦滬西儀器廠；DBS-100電腦全自動部份收集器：上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 秋葵黃酮粗樣液的制備

挑選大小均勻的秋葵嫩莢，切2 mm薄片，真空冷凍干燥24 h，粉碎后過100目篩，然后以60%乙醇溶液為提取劑，采用超聲微波聯用法在微波功率550 W，液料比 1 ∶50（g/mL），超聲 30 min，微波 60 s條件下提取秋葵中黃酮類化合物，提取后在8 500 r/min下離心5 min，將上清液在45℃下旋蒸濃縮得粗提物浸膏。

1.2.2 總黃酮含量測定

將蘆丁標準品在108℃下烘干至恒重并精確稱取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到100 μg/mL的蘆丁標準溶液；再分別精確吸取蘆丁標準液 0、2、4、8、10、16、20、25 mL 于標號 1～8 的 50 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液1.5 mL，搖勻后靜置6 min，再分別加入10%Al（NO3）3溶液1.5 mL，搖勻靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液20 mL，之后再用70%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min后510 nm下分別測定吸光值，以蘆丁的質量濃度為X軸、吸光度為Y軸，繪制標準曲線；標準曲線的回歸方程為：A=0.010 5c-0.002 0，R2=0.999 6。

1.2.3 大孔樹脂的預先處理與裝柱

按照所購買的樹脂使用說明書對大孔樹脂進行預處理，處理后將樹脂濕法裝柱，裝柱規格為Φ1.5 cm×30 cm，裝入樹脂高度為15 cm。

1.2.4 靜態吸附-解吸試驗

1.2.4.1 大孔樹脂型號篩選試驗

準確稱取預處理好的4種型號樹脂各1 g于具塞錐形瓶，每個瓶中加入30 mL濃度為0.35 mg/mL的秋葵黃酮樣液，于搖床內設定溫度25℃，轉速100 r/min，振蕩12 h使樹脂吸附飽和，測定剩余樣液黃酮濃度C1，測后將吸附飽和的樹脂過濾抽干，重置于100 mL錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，于搖床內在同樣條件下振蕩12 h，按1.2.2項下方法測定洗脫液中黃酮濃度Ce，計算吸附量、吸附率和解析率，每種大孔樹脂做3個平行，取其平均值[7-8]。

式中：C0為初始加入的黃酮樣液的濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后樣液中黃酮濃度，mg/mL；V1為初始加入的黃酮樣液體積，mL；Ce為加入乙醇洗脫后乙醇中黃酮濃度，mg/mL；V2為加入乙醇體積，mL；M 為干樹脂的吸附量，g。

1.2.4.2 靜態吸附動力學試驗

稱取1.0 g預處理好的最佳吸附型號的樹脂于具塞錐形瓶，加入濃度為0.35 mg/mL的秋葵黃酮樣液40 mL，于搖床內25℃、100 r/min條件下振蕩，每小時取0.5 mL溶液測定黃酮含量，計算大孔樹脂吸附量。每種大孔樹脂做3個平行，取其平均值，以時間為橫坐標，樹脂吸附量為縱坐標繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.5 動態吸附-洗脫試驗

1.2.5.1 上樣濃度選擇試驗

將預處理過的AB-8樹脂濕法裝柱，用3種不同黃酮濃度（0.45、0.60、0.75 mg/mL）的樣液上樣，設定恒流泵流速0.7 mL/min，自動分部收集器每5 min收集一管流出液，測定每管流出液黃酮濃度，當流出液黃酮濃度C與初始黃酮濃度C0幾乎相近時停止上樣。

1.2.5.2 上樣液流速選擇試驗

取濃度為0.55 mg/mL的秋葵黃酮樣液上樣，上樣流速分別設定0.4、0.7、1.0 mL/min，自動分部收集器隔一定時間收集一管流出液，測定每管流出液黃酮濃度，當流出液黃酮濃度C與初始黃酮濃度C0幾乎相近時停止上樣。

1.2.5.3 洗脫劑濃度選擇試驗

取60 mL濃度為0.6 mg/mL的秋葵黃酮溶液按0.70 mL/min的流速過柱。過柱后用100 mL的乙醇洗脫，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，流速0.70 mL/min，設定自動分部收集器每5 mL收集一管，跟蹤測定黃酮濃度，分別測定每管洗脫液的黃酮濃度，并計算每管中洗脫出的秋葵黃酮的質量，所有管相加即為該乙醇濃度洗脫下的總黃酮質量。最后以洗脫液體積為橫坐標，以黃酮濃度為縱坐標繪制不同乙醇濃度的洗脫曲線。

1.2.5.4 洗脫流速選擇試驗

取60 mL濃度為0.6 mg/mL的秋葵黃酮溶液按0.70 mL/min的流速過柱。過柱后用100 mL70%乙醇洗脫，洗脫流速分別設定 0.4、0.7、1.0 mL/min，設定自動分部收集器每5 mL收集一管，跟蹤測定黃酮濃度，分別測定每管洗脫液的黃酮濃度，并計算每管中洗脫出的秋葵黃酮的質量，所有管相加即為該流速所洗脫下的總黃酮質量。最后以洗脫液體積為橫坐標，以黃酮濃度為縱坐標繪制不同洗脫流速的洗脫曲線。

1.2.6 秋葵黃酮體外抗氧化活性試驗

以上述工藝純化后的秋葵黃酮為原料進行體外抗氧化活性試驗，還原力的測定采用鐵氰化鉀還原法[9]；·OH 清除率的測定采用鄰二氮菲法[10]；O2-·清除率的測定采用鄰苯三酚自氧化法[10]；DPPH·清除率的測定采用DPPH法[11]；ABTS+·清除率的測定采用ABTS 法[6]。

1.2.7 半抑制濃度（half maximal（50%）inhibitory concentration，IC50）的計算

將黃秋葵黃酮的質量濃度對·OH、DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率作圖并進行線性擬合。根據擬合的線性方程，當清除率為50%時所對應黃秋葵黃酮的質量濃度即IC50；以IC50值作為評價黃秋葵黃酮的抗氧化能力指標。

1.3 數據處理

數據均以均值±標準差表示，各組之間參數比較采用x2檢驗進行統計學分析。

2 結果分析

2.1 靜態吸附-解吸試驗

2.1.1 大孔樹脂型號的選擇

4種型號的樹脂在相同的靜態吸附條件下對秋葵黃酮的靜態吸附量與解析率見表1。

表1 四種樹脂的靜態吸附試驗Table 1 The static state absorption experiment of four kinds of resin

由表1可得，4種極性不同的大孔樹脂，其中弱極性樹脂AB-8對黃酮的吸附量最大，但是考率到解析率，則中等極性樹脂HPD-400最大，因此擬通過后續試驗綜合考慮選擇兩者之一作為最佳吸附樹脂。

2.1.2 AB-8和HPD-400樹脂靜態吸附動力學研究

AB-8與HPD-400的靜態吸附動力學曲線如圖1所示。

從圖1可看出，AB-8樹脂在靜態吸附6 h時就已達吸附平衡，比HPD-400樹脂快了2 h，因此，綜合考慮靜態吸附量與解析率以及樹脂吸附平衡速率，對于秋葵黃酮物質的吸附，以吸附樹脂類型為AB-8樹脂為最佳。

圖1 靜態吸附動力學曲線Fig.1 Static adsorption kinetics curves

2.2 動態吸附-解吸試驗

2.2.1 不同濃度上樣液的泄漏曲線

不同上樣濃度的泄漏曲線如圖2所示。

圖2 不同上樣濃度泄露曲線Fig.2 The leaking curve of different sample concentration

從圖2可以看出，上樣液濃度越高，泄露點出現時間越早，上樣濃度越低，泄露點出現時間越晚。上樣液濃度0.75 mg/mL時，泄露點最早出現，因而造成樣品有效成分過多泄漏，此外，由于上樣濃度過大，對樹脂造成了一定程度堵塞，從而既損失樹脂又浪費樣液。上樣液濃度為0.45 mg/mL時，泄露點出現最晚，但上樣效率過低，耗時過長，綜合考慮應選擇上樣濃度0.60 mg/mL。

2.2.2 不同上樣流速泄漏曲線

上樣流速對吸附的影響主要是影響被吸附物質向樹脂內部的擴散速率，若上樣流速過快，則樣液中待分離成分還未來得及與樹脂充分接觸便已經流出吸附柱，從而造成樣液浪費；上樣流速慢，則黃酮類物質與樹脂接觸時間長，分子能夠充分擴散到樹脂內，樹脂床傳質區間窄，從而可以增大吸附率，但流速過慢也使上樣時間過久。實際生產中應綜合考慮，既要使吸附率增大又需縮短生產時間提高生產效率。不同上樣流速泄露曲線見圖3。

從圖3可以看出，上樣流速為0.4 mL/min時耗時過久，流速為1.0 mL/min時泄漏過早，因此可選擇0.70 mL/min流速作為最佳上樣流速。

圖3 不同上樣流速泄露曲線Fig.3 The leaking curve of different sample flow rate

2.2.3 不同洗脫劑體積分數的洗脫曲線

由于AB-8樹脂為弱極性樹脂，因此選擇極性溶劑洗脫其解析能力強，實際應用中因為乙醇無毒環保、價格低廉易回收，所以多選擇乙醇作為極性樹脂洗脫劑。而乙醇與水以不同比例混合，其極性發生變化，可對樣液有效成分與AB-8樹脂之間的分子作用力產生影響，且有效成分在不同濃度乙醇中的溶解度也不同，因此要通過動態洗脫試驗進行最佳乙醇濃度的篩選，洗脫曲線如圖4所示。

圖4 不同濃度乙醇洗脫曲線Fig.4 The elution curve of different ethanol concentration

由圖4可以看出，洗脫液濃度越高，峰值出現越早，80%乙醇洗脫峰型最寬，所以分離效果不好；70%乙醇洗脫峰型最尖銳，相比50%、60%濃度乙醇其分離效果良好；40%乙醇洗脫峰型出現過慢且扁平拖尾嚴重。綜合考慮選擇70%的乙醇濃度進行洗脫。

2.2.4 不同洗脫流速洗脫曲線

根據上一步試驗所確定的最佳洗脫劑乙醇濃度，選擇70%乙醇在不同流速下做洗脫曲線，洗脫曲線如圖5。

由圖5也可看出，洗脫流速越慢，峰型越尖銳集中，并且拖尾現象也越不明顯，這是因為洗脫流速越小，洗脫劑能夠越充分地進入樹脂空隙，被吸附的物質越能充分接觸溶劑從而被洗脫下來。計算不同流速下洗脫下來的總黃酮量，流速0.4 mL/min時，被洗脫的黃酮質量為28.32 mg，流速0.7 mL/min時，被洗脫下的黃酮質量為26.46 mg，流速為1.0 mL/min時，被洗脫下的黃酮質量為25.42 mg；因此不管從洗脫出峰尖銳程度還是被洗脫黃酮質量來看，選擇洗脫流速為0.4 mL/min最佳。

圖5 不同流速洗脫曲線Fig.5 The elution curve of different flow rate

2.2.5 AB-8大孔樹脂純化秋葵黃酮最佳動態吸附-洗脫條件驗證

根據前面試驗結果，取60mL濃度為0.60 mg/mL的秋葵黃酮樣液按0.70 mL/min的流速上樣，再用100 mL 70%乙醇以0.40 mL/min的流速洗脫，收集全部洗脫液，揮去一部分溶劑后將剩余洗脫液轉移到一個干燥并稱重過的培養皿中，將其冷凍干燥，干燥后立刻稱重，差量法計算洗脫物質質量后再用100 mL70%乙醇復溶，測定其中黃酮含量，得到純化后黃酮純度達到67.3%，比純化前高出28.1%。

2.3 秋葵黃酮的體外抗氧化性活性

秋葵黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·清除率見圖6。

圖6 秋葵黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·自由基清除率Fig.6 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion，DPPH and ABTS+radical scavenging activities of okra flavonoids

由圖6可以看出，在所考查的秋葵黃酮濃度范圍內，秋葵黃酮與VC溶液的還原能力都隨濃度增加而增強，且秋葵黃酮提取液的還原能力要優于VC溶液。秋葵黃酮對·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·均具有一定的清除能力，且清除能力隨秋葵黃酮濃度的增加而增強，當秋葵黃酮濃度為1.0 mg/mL時，其最大清除率分別為90.4%、80.4%、77.6%、88.4%，具有良好的體外抗氧化活性。對秋葵黃酮的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·清除率與濃度進行線性擬合，其線性擬合方程分別為：Y（·OH）=115.76X-15.227，R2=0.9557；Y（O2-·）=61.83X+23.873，R2=0.975 1；Y（DPPH·）=70.624X+6.087，R2=0.980 6；Y（ABTS+·）=80.364X+8.06，R2=0.992 7，均表現出良好的線性量效關系，從而可計算出秋葵黃酮的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的 IC50值分別為 0.56、0.42、0.62、0.52 mg/mL。同理可得 VC的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的 IC50值分別為 0.46、0.34、0.27、0.35 mg/mL，由此可知秋葵黃酮的抗氧化能力僅比VC略低，有很好的開發前景。

3 結論

通過大孔樹脂靜態吸附-解吸試驗以及動態吸附-解吸試驗對秋葵黃酮吸附分離的研究可知，AB-8型大孔樹脂可作為純化秋葵黃酮類物質的最佳吸附樹脂，其純化秋葵黃酮的最佳工藝為上樣液濃度0.60 mg/mL，上樣液流速0.70 mL/min，洗脫劑乙醇濃度為70%，洗脫流速為0.40 mL/min。最佳工藝純化秋葵黃酮可使提取物黃酮純度由39.2%提高到67.3%，說明AB-8樹脂對秋葵黃酮具有良好的純化效果且該純化工藝可行。純化后的秋葵黃酮的總還原力高于VC，對·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的IC50值分別為0.56、0.42、0.62、0.52，且濃度為1.0 mg/mL時，其最大清除率分別為90.4%、80.4%、77.6%、88.4%，具有良好的體外抗氧化活性。