食品中大腸埃希氏菌O121熒光PCR檢測方法的研究

游淑珠，王小玉，蔡教英，姚麗鋒，唐食明，馮家望，丁琦，符家忍

（珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東珠海519000）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）俗稱大腸桿菌，具有對極酸性環境耐受數小時的能力使之能夠通過動物的胃進入腸道生存并繁殖，成為人和溫血動物腸道中的正常棲居菌[1-2]。部分大腸埃希氏菌中能引起人類以腹瀉癥狀為主的食源性疾病，統稱為致瀉大腸埃希氏菌（diarrheagenic E.coli，DEC）。DEC可分為6大類：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic E.coli，EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive E.coli，EIEC）、產腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（enteroaggregative E.coli，EAEC）、擴散附著大腸埃希氏菌（diffusely adherent E.coli，DAEC）和產志賀毒素大腸埃希氏菌為（shigatoxin-producing E.coli，STEC）。STEC 中部分菌株可在臨床上引起人類出血性結腸炎或出血性腹瀉，并可進一步發展為溶血性尿毒綜合征，即為腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic E.coli，EHEC），EHEC在世界上許多國家相繼發生了暴發和流行，其流行已成為全球性的公共衛生問題之一[1]。

血清型是E.coli分類的最常用方法，E.coli血清型種類繁多，E.coli的抗原成分復雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中 O 抗原是血清分型的基礎，有一百七十多種[3]。目前發現的致瀉大腸埃希氏菌與特定O抗原血清型有一定相關性，不同致瀉大腸埃希氏菌的優勢血清型不同，《伯杰氏系統細菌學手冊》列出了已發現的EPEC、ETEC、EIEC、EAEC和STEC 5種致瀉大腸埃希氏菌的相關血清型，E.coli O121 與 EIEC、STEC 相關[3-7]。

血清分型通過血清凝集試驗實現，但由于血清交叉反應、菌體自凝集、菌體表面抗原干擾等影響，E.coli血清型種類繁多，加上分型用血清售價較高、保質期短，使得傳統血清分型檢測費用居高不下，準確度、檢出率、靈敏度不盡如人意，在實際應用中大大受限。隨著以PCR技術為代表的現代分子生物學技術的發展，E.coli O抗原基因簇基因序列的公布，分子生物學檢測方法逐漸被成功應用于E.coli多種血清型的檢測，彌補了傳統血清分型的不足，實現了E.coli O抗原血清型的快速、準確、高效檢測。其在應對食品安全重大爆發事件中其優勢充分體現，如2011年5月-7月德國發生的EHEC O104：H4感染暴發疫情，波及部分歐洲其他國家及美國、加拿大等國家，HUS報告病例數表明，這也是迄今為止全球范圍內規模最大的EHEC食源性疾病暴發事件[8]，當時德國負責疾病防控與公眾健康的權威機構——羅伯特·科赫研究所（Robert Koch Institute，RKI）和我國疾病預防控制中心應對這一緊急事件均應用了PCR檢測技術[9-10]。E.coli O121血清型的PCR檢測方法也有相關報道[7，11-13]。

熒光PCR技術特異性好、靈敏度高，操作簡便、自動化程度高，可全程動態監控整個PCR反應過程，檢測結果在擴增反應過程中實時可見，不需電泳和凝膠成像步驟、檢測時間短，正以其無可取代的優勢被廣泛用于微生物檢測領域，二十一世紀以來被逐步推廣應用生物學研究、食品檢測、環境檢測、醫學檢測與診斷等行業[14]。

本研究以E.coli O121為檢測對象針對其O抗原基因簇的vioA基因建立了其血清型特異性熒光PCR檢測方法。通過對所建方法的靈敏度、特異性進行驗證，確定了所建方法對食品中E.coli O121快速檢測的適用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E.coli O121（菌種編號：ATCC BAA-2190）、E.coli O26（菌種編號：ATCC 12795）、E.coli O45（菌種編號：ATCC BAA-2469）、E.coli O103 （菌種編號：ATCC 23982）、E.coli O111 （菌種編號：ATCC 43887、ATCC 29552、ATCC 33780）、E.coli O145 （菌種編號：ATCC BAA-2216）、E.coli（菌種編號：ATCC 700078、ATCC 10798、ATCC 13706、ATCC 15597、ATCC 11229）：美國典型菌種保藏中心；E.coli O8（菌種編號：ETEC O8）、E.coli O78（菌種編號：ATCC 35401）、E.coli O78（菌種編 號 ：ETEC O78）、E.coli O124 （菌種編號：ATCC 43893）：黑龍江檢驗檢疫局提供；E.coli O4（菌種編號：EC O4）、E.coli O104（菌種編號：EC O104）：珠海出入境檢驗檢疫局保健中心提供；E.coli O157（菌種編號：CCTCC AB 200051）、E.coli（菌種編號：CCTCC AB 200068）、腸炎沙門氏菌（菌種編號：CCTCC AB 94018）、金黃色葡萄球菌（菌種編號：CCTCC AB 91053）、銅綠假單孢菌（菌種編號：CCTCC AB 91095）、單核細胞增生李斯特氏菌（菌種編號：CCTCC AB 97021）：中國典型培養物保藏中心；E.coli O157（菌種編號：NCTC 12900）、E.coli（菌 種編號：CMCC（B）44102）、金黃色葡萄球菌（菌種編號：CMCC（B）26003）、表皮葡萄球菌（菌種編號：CMCC（B）26069）、藤黃微球菌（菌種編號：CMCC（B）28001）、阪崎腸桿菌（菌種編號：ATCC 51329）、副溶血性弧菌（菌種編號：ATCC 17802）、乙型溶血性鏈球菌（菌種編號：CMCC（B）32210）、枯草芽孢桿菌（菌種編號：CMCC（B）63501）、糞腸球菌（菌種編號：CMCC（B）32220）、小腸結腸炎耶爾森氏菌（菌種編號：CMCC（B）52204）、變形桿菌（菌種編號：CMCC（B）49027）、肺炎克雷伯氏菌（菌種編號：CMCC（B）46101）、福氏志賀氏菌（菌種編號：CMCC（B）51571）、宋內氏志賀氏菌（菌種編號：CMCC（B）51334）：廣東環凱微生物科技有限公司；空腸彎曲菌（菌種編號：ATCC 33291）：美國 Microbiologics公司；嗜酸乳桿菌（菌種編號：CGMCC 1.1878）：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 培養基、試劑與溶液

EC肉湯：北京陸橋技術有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒、DNA Marker：日本 TAKARA 公司；DNA提取試劑盒（離子柱型）DP 302：北京天根生化科技有限公司；DNA裂解液：珠海科登生物工程有限公司。

1.1.3 引物、探針

在www.ncbi.nlm.nlh.gov網站上檢索的來源不同的E.coli O121的O抗原基因簇序列（GenBank序列號 ：AY208937、JN859209-JN859220），DNAMAN 軟 件比對，根據vioA基因高保守區的基因序列，利用Oligo7.0軟件設計引物、探針。上游引物：5’-ATCCGAGAAGAATTGAAGA-3’、下游引物：5’-CATG －GAAACTTAAGACACTTA-3’、探針：5’-JOE-AACACTTCCATCATCATCTTCAACG C-TAMRA-3’，均委托上海Invitrogen公司合成。引物對和探針分別用無菌超純水稀釋到儲備濃度100 μmol/L，-20℃保存，臨用時無菌超純水稀釋至10 μmol/L。

1.1.4 樣品

畜肉196份：市場上采購；水產品46份、禽產品43份、可生食蔬菜54份：珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心受理的委托檢驗樣品。

1.2 儀器與設備

核酸濃度測定儀（ND-1000）：美國NanoDrop公司；離心機（Minispin Plus）：德國 Eppendorf公司；熒光PCR儀（7500Fast）：美國ABI公司；拍擊式均質器（AES Smasher）：法國Biomerieux公司；恒溫培養箱（1565-2E）：美國SHELLAB公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌DNA模板的提取、濃度及純度的測定

指數期生長各菌株菌液，用DNA提取試劑盒并按其說明提取制備DNA模板。使用核酸濃度測定儀測定出DNA的濃度，OD260/OD280比值在1.7～1.9之間時，適用于PCR擴增。

1.3.2 熒光PCR反應體系和反應條件

反應體系：體積為 25 μL；2× Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5μL、引物對（10μmol/L）1μL、探針（10μmol/L）1 μL、50×ROX Reference Dye II 0.5 μL、模板 2 μL、無菌超純水 8 μL。

反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，收集熒光，40個循環。

1.3.3 熒光PCR特異性試驗

用DNA提取試劑盒分別提取各菌株的DNA模板，按上述條件進行熒光PCR擴增，驗證熒光PCR方法的特異性。

1.3.4 熒光PCR靈敏度試驗

將提取的E.coli O121的DNA進行10倍連續遞增稀釋至10-7濃度，將原液和各DNA核酸稀釋液分別用相同條件進行熒光PCR擴增，確定熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.5 食品樣品的檢測

1.3.5.1 制樣

無菌稱取樣品25 g至帶濾網拍擊式均質袋加入225 mL EC肉湯，拍擊式均質器均質2 min。

1.3.5.2 增菌

樣品均質后于恒溫培養箱36℃培養24 h。

1.3.5.3 核酸提取

培養結束后，取帶濾網拍擊式均質袋中培養物濾過液按熱裂解法提取核酸：1 mL培養物濾過液于1.5 mL離心管12 000 r/min離心5 min，棄上清，加DNA裂解液50 μL，于100℃金屬浴裂解5 min，冷卻后12 000 r/min離心5 min，上清備用。

1.3.5.4 熒光PCR檢測

按1.3.2中的條件進行熒光PCR檢測。

1.3.5.5 結果判定

根據熒光PCR儀給出的樣品到達域值水平所經歷的循環數（即Ct值）進行樣品結果判定。Ct值≤35時，判定檢品E.coli O121陽性；Ct值為零或≥37時，判定E.coli O121陰性。Ct值介于35～37之間判斷為可疑，采用5 μL模板量進行重復試驗，如出現指數期明顯的擴增曲線可判定為陽性，否則為陰性。

2 結果與分析

2.1 E.coli O121熒光PCR方法的建立

E.coli O121熒光PCR擴增曲線見圖1。

以E.coli O121的O抗原基因簇的vioA基因為靶基因，設計引物、探針，經反應體系優化，建立了E.coli O121熒光PCR檢測方法，E.coli O121標準菌株呈現出典型的熒光PCR擴增曲線，表明該熒光PCR反應體系適用于E.coli O121的檢測。

圖1 E.coli O121熒光PCR擴增曲線Fig.1 Amplification plot of the real-time PCR method for detection of E.coli O121

圖2 E.coli O121熒光PCR特異性試驗擴增曲線Fig.2 Amplification plot of specificity test of the real-time PCR method for detection of E.coli O121

2.2 E.coli O121熒光PCR方法特異性試驗

E.coliO121熒光PCR特異性試驗擴增曲線見圖2。

取1.1.1中所列的E.coli菌株的以及其他菌株的DNA進行實時熒光PCR擴增。結果表明，僅E.coli O121擴增出陽性增幅曲線，其它非O121 E.coli和非E.coli菌株DNA樣本的檢測結果均為陰性。據此可判斷，本研究設計的E.coli O121檢測引物和探針具有很好的特異性。

2.3 E.coli O121熒光PCR方法靈敏度試驗

E.coli O121菌株的DNA經核酸濃度測定儀測得其濃度為31 ng/μL，菌株DNA原液和7個連續10倍梯度的DNA稀釋液各2 μL用于擴增，E.coli基因組大小為0.004 pg/拷貝，菌株DNA原液模板相當于15 500 000拷貝，菌株DNA原液和7個連續10倍連續遞增稀釋的稀釋液檢測靈敏度試驗擴增曲線見圖3。

由圖3可知，本方法的檢測靈敏度可達155拷貝/反應。

2.4 食品樣品檢測

所檢的339份食品樣品中檢出E.coli O121陽性9份，陽性率2.7%，樣品檢測結果見表1。

表1 食品樣品污染調查結果統計分析Table 1 Statistics analysis of food samples pollution survey

結合樣品來源分析，196份畜肉均為市場上采購獲得的生豬肉和生牛肉，未經過食品深加工，檢出樣品E.coli O121陽性8份，陽性率4.1%；水產品、禽產品、可生食蔬菜均為本單位受理的委托檢驗樣品，多數為經過加工的產品，特別是部分水產品和禽產品為深度加工的鮮、凍產品，陽性率較低，46份水產品檢出樣品E.coli O121陽性1份，陽性率2.1%；禽產品43份和可生食蔬菜54份的E.coli O121檢測結果均為陰性。檢測結果預示樣品檢測陽性率與食品基質和加工程度存在一定相關性，食品基質營養越豐富、未經過加工或只經過初加工的產品陽性率相對較高。

3 討論

隨著現代分子生物學技術的發展，以PCR技術為代表的現代分子生物學技術以其特有的快速、準確、高效等優勢被廣泛應用于分子診斷、分子生物學研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等領域。我國2016版12月發布并于2017年6月實施的2016版GB 4789系列食品安全國家標準中致瀉大腸埃希氏菌（GB 4789.6-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》）、肉毒梭菌（GB 4789.12-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》）、諾如病毒（GB 4789.42-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗諾如病毒檢驗》）3項食品微生物學檢驗指標也首次將PCR技術納入強制性國家標準方法[4，15-16]，使得標準的科學性、實用性更強。

E.coli O121是重要的致瀉大腸埃希氏菌血清型之一，與致瀉大腸埃希氏菌中EIEC、STEC兩類相關[3-7]。開展E.coli相關血清型的分子生物學檢測方法的研究可有效彌補傳統血清分型的不足，可實現E.coli O抗原血清型的快速、準確、高效檢測，尤其利于應對食品安全緊急突發事件，意義重大。GB 4789.6-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》給出了致瀉大腸埃希氏菌相關毒力基因的PCR檢測方法，但血清學試驗仍采用傳統血清凝集進行，E.coli O抗原血清型分子生物學檢測方法的研究可提供一個良好補充。

本研究選擇E.coli O121的O抗原基因簇的vioA基因的特異性序列為靶序列，進行E.coli O121的實時PCR快速檢測方法研究。根據BLAST分析結果，所選定的引物、探針序列均與GenBank中的所有E.coli O121對應基因序列完全吻合，而與其他基因序列無明顯相關性。建立的熒光PCR方法對包括E.coli O121在內的23株E.coli細菌和19株非E.coli細菌進行檢測，結果顯示，其中E.coli O121菌株檢測為陽性，而其他細菌檢測為陰性，說明引物和探針具有高度特異性。上述引物序列分析以及特異性試驗結果說明所建立的熒光PCR方法適用于E.coli O121的快速檢測。為確定該方法檢測靈敏度，對已知濃度E.coli O121的提取每個稀釋度細菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋后進行實時熒光PCR檢測，結果顯示，原始菌液稀釋至10-5時仍能檢出，表明本檢測方法對E.coli O121的檢測靈敏度可達0.62 pg/反應，即155拷貝/反應。

本研究建立的食品中E.coli O121熒光PCR檢測方法用于全程（包括樣品前增菌、核酸提取、熒光PCR擴增反應）僅需約1.5 d，直接檢測樣品增菌液可在2 h內完成，從上機到得到檢測結果可在1 h內完成，與傳統細菌分離鑒定方法比較顯著縮短檢測時間。

通過對方法特異性、靈敏度和實際樣品污染的調查證實，本研究建立的熒光PCR快速檢測方法操作簡便、快速、特異性強、靈敏度高，縮短檢測周期，可用于食品中E.coli O121的快速檢測。