楊梅功能活性成分的UPLC-ESI-Q-TOF/MS分析

薛瑩，徐先順，雍莉，林奕希，周銀穎，謝靜，*

（1.四川省疾病預防控制中心，四川成都610041；2.成都醫學院四川養老與老年健康協同創新中心，四川成都610083；3.成都醫學院藥學院，四川成都610083）

楊梅（Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc.，英文名Waxberry），原產我國浙江余姚，目前主產區為江南地區，在湖南、廣東、廣西、貴州等多個省市也有分布。楊梅是我國傳統的特產水果，富含花青素及其糖苷、黃酮及其糖苷和酚酸等成分[1-4]，不但營養價值豐富，還具有增強免疫力、調整腸胃功能、降血糖、降血脂、抗衰老、抗突變、抗腫瘤和增加血小板數量等功效[5]。國內外對楊梅化合物成分研究都僅僅是分別對某幾個化合物進行了分析，尚未進行楊梅中功能活性成分的全面檢測。

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），作為一種軟電離的質譜離子源，可以產生較多的分子離子碎片，有助于化合物結構的解析，已廣泛應用于天然產物的結構鑒定研究[6-11]。在多種質量分析器中，飛行時間質譜（TOF/MS）具有高質量精度、高靈敏度、高分辨率等優點，可測定復雜基質中化合物的精確質量數，從而實現化合物的定性確認。同時TOF/MS還具有高掃描速度的優勢，使得其對檢測化合物的數量幾乎無限制，從而實現大量化合物的同時篩查。利用色譜的分離能力，通過化合物的精確質量數與保留時間數據，并結合二級碎片分析，可實現同分異構體鑒定，因此，LC-TOF/MS已被廣泛應用于食品中化學成分[12]、農藥殘留[13]、獸藥殘留[14]等的篩查與確證中。為了全面確定楊梅中所含功能活性成分的情況，為后續研究打下基礎，本課題充分結合利用UPLC快速分離和Q-TOF/MS準確定性優勢，結合參考文獻，對楊梅中的小分子活性化合物進行了UPLC-ESI-Q-TOF/MS定性篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

JP-020超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設備有限公司；GA110分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；移液器：大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；Heidolph勻漿機：德國SilentCrusher公司；Milli-Q型超純水儀：美國MILLIPORE公司；0.22 μm濾膜：上海安譜實驗科技有限公司；含SIL-30AC自動進樣器、LC-30AD泵和CTO-30A柱溫箱的島津超高效液相色譜：日本島津株式會社；TripleTOFR4600四級桿/飛行時間質譜：美國AB Sciex公司；其它試劑均為分析純：成都市科龍化工試劑廠；楊梅樣品：市售。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為AgilentZORBAXSB-Aq（3.0mm×100mm，1.8 μm）。流動相為0.1%甲酸水溶液（A相）、乙腈（B相），流速為 0.3 mL/min，梯度洗脫：0～5 min保持 5%B，5 min～30 min從 5%B 線性上升至 20%B，30 min～40 min從20%B線性上升至70%B，40 min～41 min從70%B線性上升至90%B，41 min～45 min保持90%B，45 min～46 min從 90%B 線性下降至 5%B，46 min～50 min保持5%B；柱溫為35℃。精密吸取對照品溶液2 μL，注入超高效液相色譜儀，測定。

1.2.2 質譜條件

電噴霧電離正離子模式儀器參數：毛細管電壓為5 000 V，霧化氣為345 kPa，輔助氣為345 kPa，氣簾氣為241 kPa，霧化溫度為500℃，去簇電壓為80 V，碰撞能為10 eV，全掃描質核比范圍為m/z 100～1 000，并采用APCI Positive Calibration Solution對儀器質量精度進行實時校正。

電噴霧電離負離子模式儀器參數：毛細管電壓為-4 500 V，霧化氣為345 kPa，輔助氣為345 kPa，氣簾氣為241 kPa，霧化溫度為500℃，去簇電壓為-80 V，碰撞能為10 eV，全掃描質核比范圍為m/z 100～1 000，并采用APCI Positive Calibration Solution對儀器質量精度進行實時校正。

1.2.3 樣品前處理

將新鮮的楊梅果肉和果核分離后，果肉放入勻漿機中勻漿，然后精密稱取1 g勻漿后的樣品，至25 mL容量瓶中，加含1%三氟乙酸的甲醇20 mL超聲提取20 min，靜置冷卻至室溫后，用含1%三氟乙酸的甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm的有機相濾膜過濾，即得待測樣品。

1.2.4 篩查方法

首先，基于楊梅屬植物和常見水果（如草莓、葡萄）中小分子化合物的已有文獻，建立一個含有100余種相關化合物的“待篩查化合物數據表”。然后在TOF/MS全掃描模式下測定楊梅樣品，通過檢測到的各成分的精確質量，運用上述“待篩查化合物數據表”進行檢索，找出可能的化合物。最后在Targeted MS/MS采集模式下進行化合物的二級質譜分析，確證相應化合物的結構。對于同分異構體，再根據色譜保留時間（出峰先后順序），參考文獻報道予以確定，如許多對同分異構體，其差別僅僅在于糖基，一個是半乳糖基，一個是葡萄糖基，前者出峰較前，后者出峰較后。

2 結果與分析

2.1 分析條件的選擇

本試驗比較乙腈（甲醇）-水（酸性水溶液）構成的多種溶劑洗脫系統，結果表明乙腈系統中化合物的理論塔板數更高，而酸性水溶液也可提高峰的對稱性[15]，因此最終采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為洗脫流動相。由于本試驗待測化合物較多，紫外吸收復雜，在不同的吸收波長下圖譜差異很大，圖譜不易解讀，故未進行紫外檢測，而直接采用TOF/MS全掃描檢測；雖然化合物未實現基線分離，但由于質譜具有分子量提取功能，只需確保UPLC將同分異構體分離開即可。本試驗還考察了不同的流速（0.2、0.3、0.4 mL/min）和不同的柱溫（25、30、35、40℃）等條件組合，結果表明，流速和柱溫對化合物出峰時間及峰形、分離度影響不大。綜合上述篩選，確定分析條件，楊梅樣品的UPLCESI-TOF/MS全掃描總離子流圖如圖1所示。

圖1 楊梅樣品的UPLC-TOF/MS全掃描總離子流圖Fig.1 The total ion current（TIC）chromatogram of Chinese waxberry by UPLC-TOF/MS

2.2 篩查結果

除了花青素類化合物，本身是正離子狀態，采用正離子掃描模式進行檢測外，其余化合物均采用正負離子同時掃描，互為對照。同時在配合二級離子碎裂，從而避免假陽性結果的產生，提高篩查的準確性。采用1.2.4所述的篩查方法，共從楊梅中篩查出28個功能活性成分，歸納整理于表1，其中包括13個黃酮及其糖苷（化合物1～13）、6個花青素及其糖苷（化合物14～19）和 9個酚類化合物（化合物 20～28）。

楊梅中含有大量的黃酮苷和花青素苷，并出現了一些同分異構體，這些異構體的苷元相同，其差別僅僅在于糖基，一個是半乳糖基，一個是葡萄糖基。雖然無論是高分辨的精確質量數還是二級碎裂特征，都無法區分它們，但是，可以通過色譜保留時間先后順序進行區分。在前期的研究中發現，如果是同樣苷元的同分異構體糖苷，半乳糖基取代的苷出峰較前，葡萄糖基取代的苷出峰則較后[10]。據此，對楊梅中的幾對同分異構體進行了結構確認。楊梅中含有的功能活性成分見表1。

表1 楊梅中含有的功能活性成分Table 1 The active ingredients detected in Chinese waxberry

2.3 黃酮糖苷和花青素糖苷的質譜裂解規律探討

從表1結果可知，黃酮糖苷和花青素糖苷是楊梅功能活性成分中最多的兩大類化合物，占比約為67%。本研究中發現黃酮苷元共3種，分別是槲皮素、山奈酚和楊梅素；花青素苷元共4種，分別是飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素和芍藥花色素，其結構如圖2所示。

續表1 楊梅中含有的功能活性成分Continue table 1 The active ingredients detected in Chinese waxberry

圖2 黃酮苷元和花青素苷元的結構Fig.2 Chemical structures of flavone aglycone and anthocyanin aglycone

2.3.1 黃酮苷的質譜裂解規律

除3個黃酮苷元外，本研究共篩查出10個黃酮苷類化合物，其二級質譜將首先丟失糖基碎片，黃酮苷在丟失糖基的過程中，會同時產生均裂和異裂兩種斷裂方式。楊梅中的黃酮苷均是3-O糖基取代，3-O糖基取代的黃酮苷一個重要二級質譜裂解特征是均裂碎片豐度大于異裂碎片豐度。以化合物5（楊梅苷，楊梅素-3-O-鼠李糖苷）為例：如圖3 A所示，在負離子模式下全掃描，化合物5的分子離子峰是m/z 463[MH]-；圖3 B為二級碎裂圖譜，可見化合物的分子離子峰m/z 463[M-H]-丟失鼠李糖基碎片后，分別產生一個均裂碎片峰m/z 316（[Yo-H]-·）和一個異裂碎片峰m/z 317（Yo-），但 m/z 316 的豐度明顯大于 m/z 317；進一步，m/z 316還產生了典型的m/z 287[Y0-H-CO-H]－碎片峰和m/z 271[Y0-H-CO-OH]－碎片峰。這一結果與文獻所報道的3-O糖基取代黃酮苷裂解規律完全一致[16-17]。楊梅素-3-O-鼠李糖苷的質譜碎裂圖及裂解示意圖如圖3所示。

圖3 楊梅素-3-O-鼠李糖苷的MS圖、MS2圖和裂解示意圖Fig.3 Typical negative ion mass spectra of myricitrin（full scan；MS2），and proposed fragmentation pathway of myricitrin

2.3.2 花青素苷的質譜裂解規律

花青素是酚類化合物中的類黃酮類，為水溶性色素，廣泛存在于植物花瓣、果實的組織中及莖葉的表面細胞與下表皮層。在自然狀態下，花青素在植物體內常與各種單糖結合形成糖苷，形成花青素苷。花青素苷類化合物本身帶正電荷，因此負離子掃描不出峰。在ESI離子源質譜碎裂時，首先將得到一個丟失糖的碎片峰，以化合物16（芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷）為例說明：在正離子模式下全掃描，化合物16的分子離子峰是m/z 463[M]+（圖4 A），分子離子峰m/z 463[M]+丟失葡萄糖后，產生一個丟失162碎片MS2峰m/z 301[M-glc]+，由于芍藥花色素苷元具有3’-OCH3結構，因此還同時產生了進一步丟失CH3碎片的碎片峰m/z 286[M-glc-CH3]+（圖4 B）。芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷的MS圖、MS2圖譜及其裂解機理如圖4所示。

圖4 芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷的MS圖、MS2圖和裂解示意圖Fig.4 Typical positive ion mass spectra of petunidin-3-O-glucoside（full scan；MS2），and proposed fragmentation pathway of petunidin-3-O-glucoside

3 結論

本研究建立無需標準品對照快速篩查楊梅中功能活性成分的超高效液相色譜－四級桿/飛行時間質譜（UPLC-ESI-Q-TOF/MS）檢測方法，全面研究楊梅中的活性成分種類。運用該方法靈敏、快速、準確地從市售楊梅樣品中共鑒定出28個功能活性成分，其中包括13個黃酮及其糖苷、6個花青素糖苷和9個酚類化合物；同時，本研究還對楊梅中的黃酮苷和花青素苷的質譜裂解規律進行探討，進一步對化合物的結構進行確證。通過此項工作，對全面篩查楊梅中可能含有的活性化合物種類，為基于楊梅的功能食品和保健食品開發打下了堅實的基礎。