利用青霉素結(jié)合蛋白檢測青霉素類抗生素殘留

鞠守勇，陳其國，李莉

（武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北武漢430074）

畜牧業(yè)為廣大人民提供生活所必需的奶、肉、蛋等畜產(chǎn)品，雖然國家加大了對該類產(chǎn)品的監(jiān)管力度，但在一些地區(qū)，仍然存在著在飼料中添加抗生素，非法使用抗生素獸藥等問題，導(dǎo)致某些地區(qū)某些產(chǎn)品存在著嚴重的抗生素殘留問題，嚴重危害消費者的身體健康。2008年10月9日，國務(wù)院通過了《乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理條例》（國務(wù)院令第536號），將抗生素殘留檢測項目列為強制性檢測項目。2008年12月31日，國家也制定了牛奶和奶粉中抗生素殘留的檢測標準GB/T 22975-2008《牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。國家雖然加強了對畜牧業(yè)養(yǎng)殖中抗生素使用的監(jiān)管，也制定了一系列的管理條例以及標準，但是目前的現(xiàn)狀并不樂觀[1]。

青霉素類（β-內(nèi)酰胺類）抗生素因其價格低廉、抗菌譜廣泛一度成為我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖中使用最普及的一類抗生素，不可避免地在各種畜牧業(yè)食品中造成殘留。長期攝入含有青霉素類抗生素殘留的食品則破壞人體胃腸道等菌群的平衡，造成腹瀉等癥狀，嚴重時甚至引起呼吸困難，休克，危及生命[1]。食品中青霉素類抗生素殘留檢測方法主要有：理化檢測法、微生物法和免疫檢測法[2-4]。理化檢測法主要包括：氣相色譜（gas chromatography，GC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）、熒光分析等[2-5]，例如，目前牛奶和奶粉中青霉素類抗生素殘留國家標準檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法GB/T 22975-2008《牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，理化檢測法有諸多優(yōu)點，但該類方法往往需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品必須經(jīng)過繁瑣的前處理。免疫檢測法一般是利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)，這種方法具有操作簡單、成本低廉、靈敏高、特異性強、檢測快速等優(yōu)點[3-4，6]。目前，這種方法越來越多被用于食品中抗生素殘留的檢測，國外已經(jīng)有免疫檢測抗生素殘留試劑盒上市。例如英國Randox公司、意大利Tecna及美國 Charm Science 公司等[2，6]。

青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein，PBP），因能和青霉素類抗生素共價結(jié)合而得名，該蛋白質(zhì)是一類在細菌肽聚糖生物合成中起重要作用的酶類，它一般具有糖基轉(zhuǎn)移酶、肽基轉(zhuǎn)移酶和羧肽酶（D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶）活性，能夠催化肽聚糖聚合和交聯(lián)[7]，根據(jù)PBP的相對分子質(zhì)量大小及催化活性不同，可以將PBP分為PBP1、PBP2、PBP3等三大類[8]。肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）耐藥菌株和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的PBP研究比較深入，肺炎鏈球菌共有 PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b和PBP3這6種PBP，金黃色葡萄球菌存在5種 PBP，分別是 PBP1、PBP2、PBP3、PBP4 及 PBP2b[9]。PBP的研究重點往往在于PBP與青霉素類抗生素共價結(jié)合的能力[7-9]，該蛋白質(zhì)用于食品青霉素類抗生素殘留檢測的應(yīng)用比較少。

本文從蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中克隆并表達了一種新型青霉素結(jié)合蛋白Bt-PBP3，并證實其與多種青霉素類抗生素有特異性相互作用，利用直接競爭性酶聯(lián)免疫方法證實該蛋白可以檢測牛奶中多種青霉素類抗生素殘留，為下一步研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的牛奶中青霉素類抗生素快速檢測試劑盒提供了寶貴的基因及蛋白質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）BMB171、大腸桿菌E.coli DH5α、大腸桿菌表達宿主E.coli BL21（DE3）、表達質(zhì)粒 pET28a（+）：Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值7.0～7.4，121℃滅菌30 min。限制性內(nèi)切酶、pfu Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等分子生物學(xué)試劑：北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；Ni-AgaroseHis標簽蛋白純化試劑盒（CW0894S）：北京康為世紀生物科技有限公司；氯化鈉、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林等常規(guī)生化試劑均：國藥集團。

1.1.3 儀器

PCR 儀（Peltier Thermal Cycler）：美國 MJ Research公司；離心機（Eppendorf 5415D）：德國 Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)（3Y GAS-2000）：美國柯達公司；電泳儀（DYY-11）：北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 Bt總DNA的提取

按照文獻[10]方法提取總DNA。挑取Bt BMB171菌株，液體LB培養(yǎng)基活化后1%轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，30℃，300 r/min左右培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 Bt-pbp3基因的克隆

按照文獻[10]方法以Bt BMB171總DNA為模板，PCR擴增Bt-pbp3基因。PCR反應(yīng)體系為：總DNA模板 1 μL，引物（10 μmol/L）各 2 μL，dNTP 2 μL，Pfu Taq 酶 1 μL，總反應(yīng)體系 50 μL。反應(yīng)程序 94 ℃ 5 min，95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)。

1.2.3 Bt-pbp3基因的表達載體的構(gòu)建

按照文獻[10]方法，瓊脂糖電泳后分別切膠回收PCR 產(chǎn)物與 pET28a（+）載體，37℃NdeI和 XhoI雙酶切，切膠回收外源和載體，T4連接酶16℃過夜連接，CaCl2法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E.coli BL21（DE3），涂布含有卡拉霉素LB平板中，24小時后，進行質(zhì)粒快檢，隨機選取3個陽性結(jié)果，轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集菌體抽取質(zhì)粒，酶切驗證，再測序驗證無突變后為表達載體pET28a（+）-pbp3構(gòu)建成功。表達菌株E.coli BL21（DE3）（pET28a（+）-pbp3）命名為 E.coli Bt-PBP3。

1.2.4 Bt-PBP3蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

按照文獻[10]方法，挑取E.coli Bt-PBP3單菌落，37℃過夜活化，1/100接種至卡拉霉素LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，16℃，250 r/min過夜誘導(dǎo)培養(yǎng)后菌液冰上預(yù)冷5 min；4℃，12 000 r/min離心收集菌體，預(yù)冷無菌水洗滌菌體一遍。按照Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒說明書操作方法（www.cwbiotech.com），提取可溶性蛋白。隨后10 kDa截流管去除咪唑，PBS復(fù)溶，得到純化蛋白質(zhì)Bt-PBP3。

1.2.5 Bt-PBP3蛋白測定牛奶中青霉素類抗生素殘留

用PBS配制不同濃度梯度青霉素類抗生素標準溶液，用辣根過氧化酶標記的不同的青霉素類抗生素（horseradish peroxidase-ampicillin，HRP-Amp），制成終濃度為2 g/L PBS緩沖溶液，純化的Bt-PBP3蛋白作為包被蛋白，參照文獻[2]直接競爭微孔板檢測方法，具體步驟如下：用PBS將純化的Bt-PBP3稀釋成適當(dāng)濃度加至酶標板，每孔100 μL，4℃過夜。傾去孔內(nèi)液體，每孔加入 300 μL PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗滌液洗滌，在吸水紙上拍干。每孔中加入150 μL 1%BSA封閉液，37℃孵育3小時后直接甩干。各孔依次加入50 μL反應(yīng)緩沖液或者標準品、50 μL稀釋成一系列濃度的酶標記物，37℃孵育30 min。傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3遍，吸水紙上拍干。加入100 μL新配置的四甲基聯(lián)苯胺溶液（tetramethyl benzidine，TMB），室溫避光孵育10 min，立即向每孔中加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液，藍色變黃色，迅速放入酶標儀中，450 nm波長測定吸光度值A(chǔ)450。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗重復(fù)3次以上，所得數(shù)據(jù)用進行Origin軟件方差分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt-pbp3基因的克隆

根據(jù)已經(jīng)報道的與青霉素類抗生素有高親和力的蛋白質(zhì) PBP3序列（GI：15458372），通過 BLASP 掃描蘇云金芽胞桿菌BMB171基因組[11]，發(fā)現(xiàn)一個其同源覆蓋度為92.4%，相似度為36.6%的蛋白質(zhì)，全長為415個氨基酸，分子量為45.5 kDa，命名為Bt-PBP3，其基因命名為Bt-pbp3。根據(jù)該基因的序列，在該基因上游添加NdeI酶切位點設(shè)計引物為CCGCATATGCCATATAGCAATGCATC，下游添加XhoI酶切位點設(shè)計的引物為：CGCTCGAGTTAAAACCAACCTTTTACTG，PCR擴增該基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致約1.3 kb（圖1），測序表明PCR產(chǎn)物核苷酸序列與預(yù)期一致。

圖1 PCR擴增得到Bt-pbp3基因的凝膠電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis of gene Bt-pbp3 amplification products

2.2 表達載體pET28a（+）-pbp3的構(gòu)建

分別用NdeI和XhoI雙酶切擴增得到的PCR產(chǎn)物Bt-pbp3與載體pET28a（+），切膠回收載體和外源，T4連接酶連接成pET28a（+）-pbp3重組載體，轉(zhuǎn)化表達宿主菌E.coli BL21（DE3），提取質(zhì)粒用EcoRV，XhoI酶切驗證與預(yù)期符合大小為3.9、2.5 kb（圖2），測序結(jié)果表明pbp3基因未發(fā)生突變，表明表達宿主菌E.coli BL21（DE3）（pET28a（+）-pbp3）構(gòu)建成功，將其命名為E.colI Bt-PBP3。

圖2 pET28a（+）-pbp3用EcoRV，XhoI酶切片段Fig.2 The cleaved fragments of pET28a（+）-pbp3 using EcoRV，XhoI restriction enzyme

2.3 Bt-PBP3蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

依照1.2.4方法誘導(dǎo)并純化蛋白質(zhì)Bt-PBP3，用10 kDa截流管去除咪唑，用PBS緩沖溶解Bt-PBP3蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE顯示純化的蛋白為單一條帶且無明顯雜蛋白，蛋白質(zhì)分子量大小分子量約為45 kDa符合預(yù)期（圖3），以小牛血清白蛋白（BSA）為指示蛋白，標準繪制標準曲線，測定蛋白質(zhì)濃度。

圖3 SDS-PAGE檢測大腸桿菌中分離提取的Bt-PBP3蛋白質(zhì)Fig.3 The SDS-PAGE of Bt-PBP3 protein extracted from E.coli

2.4 Bt-PBP3蛋白質(zhì)測定牛奶中青霉素G殘留

配置青霉素G標準溶液，濃度0.25 ng/mL到1 024 ng/mL兩倍遞增。依照方法12.5方法，測定不同青霉素標準溶液中與Bt-PBP3在450 nm波長測定吸光度值A(chǔ)450。在青霉素G濃度在1 ng/mL到64 ng/mL區(qū)間中，兩者有很好的共線性，以A450為縱坐標，青霉素G濃度為橫坐標，標準曲線為B/B0=-0.202 4 ln（CAmp）+0.9606，R2=0.9969。計算得出其IC50=4.842ng/mL（圖4）。

圖4 不同濃度青霉素G下測定的標準曲線Fig.4 Calibration curve of penicillin G in different concentrations

根據(jù)檢出限的定義LOD=3δcef/D（其中δcef為空白的相對標準偏差，D為線性方程的斜率）計算，本方法測定青霉素殘留的檢出限為1.49 ng/mL。依據(jù)此方法測定氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林的檢測標準曲線，表1表明這6種青霉素類抗生素藥的殘留檢測限除氨芐西林高于國家標準檢測限之外，靈敏度稍差，其他均低于國家標準檢測限，能滿足青霉素類抗生素殘留的檢測要求。

表1 檢測靈敏度Table 1 The detection sensitivity

2.5 Bt-PBP3蛋白質(zhì)測定牛奶中青霉素類抗生素的檢測靈敏度

在不含有青霉素G的脫脂牛奶中添加一定量的青霉素G，添加終濃度為2.5、5、10 ng/mL，平行檢測樣品中青霉素G的含量，6個平行重復(fù)，表2結(jié)果表明，當(dāng)牛奶中添加濃度分別是2.5、5、10 ng/mL時，其添加回收率分別平均達到 （88.9±13.1）%、（90.8±8.4）%、（94.0±7.2）%，表明該方法能用于牛奶中青霉素G殘留的測定。

表2 添加回收率的測定Table 2 The test of adding recovery rate

3 結(jié)論

本文從蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiesis，Bt）中克隆并表達了一種與青霉素類抗生素具有廣譜高親和力的新型青霉素結(jié)合蛋白Bt-PBP3，并且建立了直接競爭酶聯(lián)法快速準確的測定牛奶中青霉素類抗生素的殘留的方法，該方法檢測青霉素類抗生素的限度低于國家標準且具有靈敏度高，操作簡單，能滿足快速檢驗和測試的需求。該蛋白質(zhì)的克隆表達為進一步研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的青霉素殘留免疫檢測產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。