玳玳花黃酮提取物抗肝癌細胞氧化損傷作用探究

龐海月，吳黌坦，鄭永標，陳煜沛，黃立森，葉子堅，王貴弘

（1.廈門醫(yī)學院醫(yī)學技術系，福建廈門361023；2.廈門醫(yī)學院天然化妝品福建省高校應用技術工程中心，福建廈門361023；3.福建師范大學生命科學學院工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州350117）

玳玳花（Citrus aurantium）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus reticulata Banco）的常綠灌木，分布于中國南部各地區(qū)。玳玳花全草含有強心甙和非強心甙類成分，在多國藥典中均有記錄。中醫(yī)稱之具有強心、鎮(zhèn)靜、疏肝理氣、消食、化痰等功效，用于治療慢性心功能不全、充血性心力衰竭和癲癇等急性病。玳玳花作為茶飲，微苦，香氣濃郁，具有減肥瘦身的效果。玳玳花花蕾中的揮發(fā)油主要有檸檬烯、芳樟醇、香茅醇、牦牛兒醇等。文獻檢索發(fā)現(xiàn)，玳玳花的研究多集中于其香氣和精油成分，對其萃取物的整體研究較少。

隨著科技的發(fā)展，人類在人體衰老課題研究中取得越來越多成果，尤其對氧化損傷與衰老的關系進行了較多闡述，更初步證實了自由基引起的氧化損傷是人體衰老的主要元兇。本研究采用5種體外抗氧化活性評價方法對玳玳花黃酮的抗氧化活性進行初步評價，并利用H2O2和對乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol，APAP）誘導的肝癌細胞損傷模型，對其細胞水平的抗氧化能力進行測定，為其之后能夠作為天然食品和化妝品類抗氧化劑及抗衰老的應用做基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玳玳花由福建省農科院生態(tài)所林忠寧副研究員提供；人肝腫瘤細胞株HepG2來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

大孔吸附樹脂D101、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene，BHT）、吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）、硝基藍四氮唑（Nitro blue tetrazolium，NBT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、對乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol，APAP）、沒食子酸（Gallic acid，GAE）、福林酚（Folinciocalteau reagent）：國藥集團化學試劑有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）：美國Sigma公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）、10 mmol/L Trolox標準溶液：碧云天生物技術研究所。所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FreeZoneR冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；EYELA旋轉蒸發(fā)儀N-1100：日本東京理化器械株式會社；多功能酶標儀SpectraMaxRi3x：美國Molecular Devices公司；梅特勒ME204E電子天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；Thermo BB15 CO2細胞培養(yǎng)箱：精藝興業(yè)科技有限公司；徠卡DMi8倒置顯微鏡：精藝興業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玳玳花黃酮的獲取

玳玳花粉碎后，準確稱取100 g，加純水[液料比5∶1（mL/g）]，超聲波功率為 600 W，超聲萃取 4 h，過濾，45℃水浴減壓旋轉濃縮，濃縮至褐色浸膏。經少量純水重新溶解后，濾紙過濾，冷凍干燥處理得到粗提物樣品12.16 g，4℃冰箱備用。

稱取大孔樹脂D101 50 g，加入無水乙醇浸泡24 h激活。之后將激活的大孔樹脂裝入長25cm，直徑1.5cm的層析柱中，用無水乙醇沖洗至洗脫液滴入純水中無渾濁現(xiàn)象，再用純水洗脫至洗脫液澄清，管柱上方留1 cm～2 cm高的液面。稱取1.3.1中得到的粗提物樣品1 g用少量純水溶解后，濕法上樣。先用純水200 mL洗脫后，再用25%的乙醇-水溶液洗脫，此洗脫液經減壓濃縮，冷凍干燥后即為玳玳花黃酮（Citrus aurantium flavones，CF），黃酮含量為 2.68 mg/g。

1.3.2 總抗氧化能力測定

參照ABTS試劑盒說明配制ABTS所需工作溶液。用樣品配制溶液對標準品進行稀釋。把10 mmol/L Trolox 標準溶液依次稀釋成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。在96孔板的每孔中加入200 μL ABTS工作液，空白對照孔中加入10 μL蒸餾水；標準曲線檢測孔內加入10 μL各濃度的Trolox標準溶液；樣品檢測孔中加入10 μL待測樣品。將加好樣品的孔板混和均勻，室溫孵育2 min～6 min后測定734 nm處的吸光值。根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力，用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity（TEAC）表示，即所測樣品的總抗氧化能力用同等抗氧化效果的Trolox的濃度來代表。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻[3]方法，準確稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配置成0.1 mmol/L的溶液，避光冷藏備用。將待測樣品稀釋成不同濃度（0.012 5、0.025、0.5、1 mg/mL），陽性對照和空白對照分別采用BHT和無水乙醇。取200 μL樣品液和對照溶液，均加入等體積的0.1 mmol/L DPPH溶液，渦旋混勻，室溫下避光反應30 min，在517 nm測定吸光值，計算DPPH自由基清除率。

式中：OD0為不加樣品的空白組；OD1為扣除干擾色后的樣品組。

1.3.4 清除超氧陰離子（SOD-like）能力測定

用無菌水配制 60 μmol/L PMS、468 μmol/L NADH及150 μmol/L NBT工作液。取100 μL無菌水、濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL 的樣品溶液和BHT溶液依次與100 μL PMS、NADH及NBT溶液混合均勻，加入96孔板中，每個濃度設置3孔重復，室溫靜置5 min后，以酶標儀測各孔于560 nm處的吸光值。

式中：A0為未添加樣品的對照組；A1為添加樣品的實驗組。

1.3.5 MTT檢測樣品對HepG2細胞株的作用

選擇對數(shù)生長期貼壁細胞，以每孔100 μL（5×103個細胞）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入用DMSO溶解的樣品（終濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL）每個濃度設3組重復，補充培養(yǎng)液使每孔的總體積為200 μL（每孔的DMSO含量低于2.5%），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。空白對照組（Control）以含DMSO的培養(yǎng)液代替樣品，空白調零組為無細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)結束后，每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培養(yǎng)5 h，吸除干凈每孔中的培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO充分溶解，用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光值，計算細胞相對存活率。

式中：A0為未添加樣品的對照組；A1為添加樣品的實驗組。

1.3.6 HepG2細胞株氧化損傷測定

選擇對數(shù)生長期貼壁細胞，以每孔100 μL（5×103個細胞）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入用DMSO溶解的樣品（終濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL）每個濃度設3組重復，補充培養(yǎng)液使每孔的總體積為200 μL（每孔的DMSO含量低于2.5%），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為400 μmol/L H2O2（或12 mmol/L APAP）繼續(xù)培養(yǎng) 6 h。空白對照組（Control）以含DMSO的培養(yǎng)液代替樣品，空白調零組為無細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)結束后，在倒置顯微鏡下觀察各組檢測孔中細胞形態(tài)的變化并拍照。之后每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培養(yǎng)5 h，吸除干凈每孔中的培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO充分溶解，用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光值，計算細胞相對存活率。

式中：A0為未添加樣品的對照組；A1為添加樣品的試驗組。

2 結果與分析

2.1 CF抗氧化活性

以Trolox為標準物質，測得標準方程：R2=0.999 1通過標準方程計算CF總抗氧化能力，結果表明，CF的總抗氧化活性為（5.28±0.02）mmol/g；通過對DPPH自由基清除能力測定，結果表明其半數(shù)抑制率濃度為（0.52±0.02）mg/mL；通過對超氧陰離子（SOD-like）清除能力測定，結果表明其半數(shù)抑制率濃度為（0.074±0.002）mg/mL。

2.2 CF對HepG2人肝癌細胞株的作用

CF對HepG2細胞株的作用見圖1。

通過MTT試驗檢測CF對人肝癌細胞株HepG2的作用，結果表明CF對HepG2無明顯抑制或增強的效果。

2.3 CF抗H2O2誘導的人肝癌細胞株HepG2氧化損傷測定

CF對H2O2誘導HepG2細胞株氧化損傷的作用見圖2。

圖1 CF對HepG2細胞株的作用Fig.1 The effect of Citrus aurantium flavones on HepG2 cell lines

圖2 CF對H2O2誘導HepG2細胞株氧化損傷的作用Fig.2 The effect of Citrus aurantium flavones on hydrogen peroxide-induced oxidative stress of HepG2 cell lines

通過測定CF對H2O2誘導的HepG2的氧化損傷作用，結果表明，在設置的濃度范圍內，CF在該模型中表現(xiàn)的作用不同，其中玳玳花黃酮濃度在0.04 mg/mL時，較顯著的降低細胞氧化損傷水平。從圖2a中H2O2處理組可以看出，H2O2誘導的HepG2細胞在形態(tài)出現(xiàn)明顯鼓泡、變圓，而經CF預處理的HepG2細胞較H2O2處理組在細胞形態(tài)上均有明顯改善，圖2b中的柱狀圖更直觀的表明不同濃度CF在細胞水平上對H2O2誘導的HepG2的氧化損傷具有一定的修復作用。

2.4 CF抗APAP誘導的HepG2人肝癌細胞株氧化損傷測定

CF對APAP誘導HepG2細胞株氧化損傷的作用見圖3。

圖3 CF對APAP誘導HepG2細胞株氧化損傷的作用Fig.3 The effect of Citrus aurantium flavones on 4-acetamidophenol-induced oxidative stress of HepG2 cell lines

通過測定CF對APAP誘導的HepG2的氧化損傷作用，結果表明，CF濃度在0.04 mg/mL時，能夠降低細胞氧化損傷水平，但當濃度大于0.1 mg/mL或低于0.04 mg/mL時，表現(xiàn)出和12 mmol/L APAP相近的細胞毒性。從圖3a可以看出，APAP誘導的HepG2細胞在形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮、變圓甚至破裂等，而經CF預處理的HepG2細胞較12 mmol/L APAP預處理組在細胞形態(tài)上有一定改善，圖3b中的柱狀圖更清晰的看出CF在設定的濃度范圍內，在APAP誘導的HepG2的氧化損傷模型中的作用效果。

3 結論

采用總抗氧化能力、DPPH清除能力和SOD清除能力3種生化指標與H2O2和APAP誘導的HepG2細胞模型，共同評估玳玳花黃酮的抗氧化損傷能力。發(fā)現(xiàn)CF在生化水平測試中表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，而兩種細胞模型測定的結果又表現(xiàn)出一定的差異性。在APAP模型中，CF濃度高于0.1 mg/mL時，出現(xiàn)與APAP近似甚至更強的毒性。CF較好的抗氧化能力可為其在食品天然防腐劑的應用提供事實依據(jù)，而CF在較高濃度，與APAP共用時表現(xiàn)強烈細胞毒性這一點為其提供了使用量和配伍時的禁忌。本次的研究結論為玳玳花黃酮類提取物之后開發(fā)成天然抗氧化劑奠定了一定的理論基礎。