慢性情緒應激對急性心肌梗死后骨髓c-kit+干細胞動員的影響

王超，杜泓森，侯季秋，燕莎莎，王昀，趙海濱

焦慮、抑郁等慢性情緒應激作為常見的精神心理疾病，已成為影響生活質量的首要病因。作為冠心病發生、發展的獨立危險因素，焦慮、抑郁在冠心病患者中的發病率約30%，合并焦慮、抑郁的冠心病患者重度心力衰竭、惡性心律失常等并發癥的發生率明顯高于非焦慮、抑郁人群[1]。研究顯示，急性心肌梗死發生后，壞死的心肌誘發炎癥反應，而炎癥反應激活可能是連接慢性情緒應激與心肌梗死病理進程的關鍵途徑。炎癥反應可動員骨髓c-kit+干細胞釋放入血并遷移至梗死部位發揮心肌修復的作用，但過于劇烈的炎癥反應則可抑制骨髓c-kit+干細胞動員并促進其凋亡[2-5]。那么焦慮、抑郁等慢性情緒應激是否可放大心肌梗死后的炎癥反應？雙重因素導致的炎癥狀態對骨髓c-kit+干細胞的動員有何影響？核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路作為炎癥反應的起始環節，在其中是否發揮作用？本文研究了慢性情緒應激對心肌梗死后骨髓c-kit+干細胞動員的干預效應，并初步探討了與NF-κB介導的炎癥反應的可能相關機制。

1 材料與方法

研究資料：健康SPF級雄性SD大鼠，體重170～190 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房。實驗試劑及儀器：c-kit+-PE、c-kit+-APC流式抗體（北京博奧森生物技術有限公司），NF-κB 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），流式細胞儀（美國BD公司），小動物呼吸機（上海奧爾科特生物技術有限公司），小動物超聲影像系統（加拿大Visual Sonics公司），全自動三導聯心電圖（美國BD公司）。

建模方法及分組：本研究采用兩種慢性情緒應激方案，分別建立焦慮和抑郁的慢性情緒應激模型，并與冠狀動脈左前降支結扎建立心肌梗死模型相結合，分別建立心肌梗死合并焦慮、心肌梗死合并抑郁的大鼠模型。根據隨機數字表將動物分為假手術組、心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組，每組6只。

心肌梗死模型建立：大鼠經1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，經口連接氣管插管后接小動物呼吸機。于左側肋骨第三、四肋間打開胸腔，用5-0帶線縫合針結扎左側心耳下2 mm部位。術后腹腔注射0.2 ml利多卡因以防止心律失常，40萬單位青霉素預防術后感染。以術后第二天心電圖Ⅰ、aVL、V1～V6導聯中有6個以上導聯出現病理性Q波為心肌梗死成功標志。假手術組穿線后打松結，其余步驟相同。

不確定空瓶刺激法建立焦慮模型：參照文獻[6]，建模周期共21天，建模期間大鼠自由飲食。第1～7天每天9:00～9:10和21:00-21:10早晚分兩次給予飲水，其余時間禁水讓大鼠處于口渴狀態。第8～21天每日早晚隨機一個時間段給予空瓶，另一個時間段喂水。

孤養+慢性不可預知性應激建立抑郁模型：參照文獻[7]，建模周期共21天。建模期間每只大鼠單籠飼養，同時禁食、禁水、夾尾巴、晝夜顛倒、潮濕墊料、鼠籠傾斜、束縛七種刺激每天隨機選擇一種進行刺激，每種刺激共進行3次。

于慢性情緒應激建模的第15天對大鼠實施心肌梗死手術，建模第22天對動物進行超聲心動圖檢查及行為學測試后處死動物，取外周動脈血、心臟以及大腦。

超聲心動圖檢測：大鼠經1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，仰臥固定，左胸前備皮，取左心室短軸切面，探測M型曲線，每只鼠取3個連續心動周期，記錄大鼠的左心室射血分數（LVEF）、左心室縮短分數（LVFS）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室舒張末期容積（LVEDV）。

曠野試驗（OFT）：試驗裝置為100 cm×100 cm×40 cm的木制箱，底板有25個方格（20 cm×20 cm），正上方2 m處有一個攝像系統，其視野可覆蓋整個曠場內部。將大鼠放在中央格后，開始計時并攝像，共計3 min。記錄大鼠在曠場箱內水平運動得分（每越過一個格子記1分）以評價大鼠的水平運動能力，記錄大鼠垂直運動得分（每直立一次記1分）以評價大鼠的垂直運動能力。

高架十字迷宮（EPM）：試驗裝置由兩條相對開放臂（50 cm×10 cm）和兩條相對閉合臂（50 cm×50 cm×10 cm）及中央區（10 cm×10 cm）連接而成，距離地面50 cm。將大鼠從中央格面向開放臂放入，記錄5 min內的活動情況。記錄大鼠在開放臂停留的時間（OE），進入開放臂的次數（OT），在閉合臂停留的時間（CE），進入閉合臂的次數（CT）以評價動物焦慮程度，計算 OE/（OE+CE）以及 OT/（OT+CT）的比值。

強迫游泳（FST）：試驗裝置為一個直徑20 cm、高46 cm的圓形透明有機玻璃筒，水深20 cm左右以大鼠掙扎過程中后爪剛好離開桶底為宜，水溫24℃左右。將大鼠放入游泳池中，使其自由游泳6 min，記錄大鼠在后四分鐘內漂浮在水面不動的時間。

HE染色及Masson染色：大鼠麻醉后，打開胸腔，自左心室插入灌流器用10%中性福爾馬林溶液灌注固定，摘取心臟和大腦浸泡于10%中性福爾馬林溶液48 h后制備石蠟切片，心臟切片行Masson染色及HE染色，大腦切片行HE染色。

ELISA法檢測外周血NF-κB含量：參照文獻[8]，大鼠麻醉后，腹主動脈采血置于含促凝劑的采血管中，靜置30 min，600 g離心15 min，取血清，根據ELISA試劑盒說明書步驟進行指標檢測。

流式細胞術檢測骨髓和外周血c-kit+干細胞數量：大鼠麻醉后，腹主動脈采血置于含乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，加入c-kit+-APC熒光抗體孵育，磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.4）清洗并重懸后上流式細胞儀檢測外周血c-kit+干細胞數。分離大鼠股骨，在骨骺端剪開一小缺口插入10 ml注射器，用PBS沖出骨髓，加入紅細胞裂解液，加入c-kit+-PE熒光抗體孵育，PBS清洗并重懸后上流式細胞儀檢測骨髓c-kit+干細胞數。

統計學方法：采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學處理。各組數據經正態性檢驗和方差齊性檢驗，若數據符合正態分布，計量資料采用均數±標準差表示，若方差齊則采用單因素方差分析，方差不齊時采用Welchi檢驗，必要時采用LSD檢驗進行兩兩比較；若不符合正態分布，計量資料采用中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用非參數檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標的比較（圖1）

圖1 各組大鼠超聲心動圖指標的比較（n=6）

心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死

2.2 各組大鼠的動物行為學指標比較（圖2）

曠野試驗結果顯示，相比于心肌梗死組，心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組的大鼠水平運動得分和垂直運動得分減少，活動能力下降，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。高架十字迷宮試驗結果顯示，相比于心肌梗死組，心肌梗死合并焦慮組大鼠傾向于待在閉合臂里，差異具有統計學意義（P＜0.05）。強迫游泳試驗顯示，相比于心肌梗死組，心肌梗死合并抑郁組大鼠水中不動時間延長，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠病理染色結果的比較（圖3）

大腦HE染色結果示：假手術組大鼠的大腦海馬CA3區細胞排列整齊，連接緊密，細胞質淡粉著色；心肌梗死組大鼠的大腦海馬CA3區細胞排列稍顯紊亂，心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組大鼠的大腦海馬CA3區細胞排列紊亂明顯，部分細胞質染色不均。心肌HE染色結果示：假手術組大鼠的心肌細胞結構正常，肌纖維排列整齊規則，肌絲清晰；心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組大鼠的心肌肌纖維斷裂，核碎裂，心肌細胞數量減少，間質纖維化增多。心肌Masson染色結果示：假手術組心肌纖維紅染，肌細胞排列整齊，橫紋可見，未見明顯膠原纖維；心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組心肌細胞排列紊亂，心肌橫紋消失，腫脹并伴有數量減少，組織間質可見顯著膠原纖維及炎性浸潤，梗死部位可以見空泡樣改變，膠原纖維呈彌散樣分布。

圖2 各組大鼠行為學指標比較（n=6）

圖3 各組大鼠心肌、大腦組織HE染色（×400）和Masson染色（×400）結果

2.4 各組大鼠外周血NF-κB含量的比較（圖4）

ELISA結果顯示， 心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組大鼠的NF-κB含量高于心肌梗死組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 酶聯免疫吸附法測定各組大鼠外周血NF-κB含量（n=6）

2.5 各組大鼠的骨髓和外周血c-kit+干細胞數量比較（圖5）

相比于心肌梗死組，心肌梗死合并焦慮組大鼠骨髓合并抑郁組的LVEF和LVFS低于假手術組，LVEDV和LVESV高于假手術組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。心肌梗死合并焦慮組和心肌梗死合并抑郁組的LVEF和LVFS低于心肌梗死組，LVEDV和LVESV高于心肌梗死組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。c-kit+干細胞數減少，心肌梗死合并抑郁組大鼠外周血c-kit+干細胞數減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 流式細胞術比較各組大鼠骨髓和外周血c-kit+細胞數量（n=6）

3 討論

本研究采用經典的結扎冠狀動脈左前降支方法建立心肌梗死模型，采用不確定空瓶刺激法建立焦慮模型，采用孤養+慢性不可預知性刺激建立抑郁模型。目前對焦慮或抑郁的評價多采用經典的行為學評價。焦慮動物表現為對高架十字迷宮中開放臂的探究次數減少以及停留時間減少，曠場實驗中水平或者垂直運動能力下降。抑郁動物表現為在曠場實驗中水平或者垂直運動能力下降低以及在強迫游泳實驗中漂浮時間增加[7]。本研究結果證明，心肌梗死、心肌梗死合并焦慮以及心肌梗死合并抑郁等動物模型成功建立，可用于心肌梗死合并焦慮或抑郁的疾病研究。

c-kit+干細胞能夠修復損傷的心肌，但是由于心臟源性干細胞數量較少難以達到理想修復效果。心肌梗死發生后，壞死的心肌組織刺激機體釋放的NF-κB等炎癥因子可動員自身干細胞遷移至心肌梗死部位，該過程在心肌梗死發生3～7天后達到高峰，其中約有74%的c-kit+干細胞來源于骨髓[9-12]。而過度增加的NF-κB可介導白細胞與內皮間的黏附反應促進骨髓干細胞的凋亡[3]。因此，NF-κB介導的炎癥反應是骨髓干細胞動員的雙刃劍，在一定范圍內，炎癥反應可促進骨髓c-kit+干細胞動員，而當炎癥反應增強到某個程度，則會減弱甚至抑制骨髓c-kit+干細胞的動員。

本研究結果顯示，相比于心肌梗死組大鼠，心肌梗死合并焦慮組和心肌梗死合并抑郁組的大鼠血清NF-κB的含量升高，且心功能明顯減退，證明了焦慮抑郁導致心肌梗死后心功能的惡化，并加重心肌梗死發生后的炎癥反應。此外，相比于心肌梗死組大鼠，心肌梗死合并焦慮組及心肌梗死合并抑郁組的大鼠骨髓或外周血c-kit+細胞數量均存在不同程度下降，證明焦慮或抑郁可增加心肌梗死后NF-κB的含量，抑制c-kit+干細胞的動員。

綜上所述，采用不確定空瓶法聯合冠狀動脈左前降支結扎法可建立急性心肌梗死合并焦慮的大鼠模型，采用孤養+慢性不可預知性刺激聯合冠狀動脈前降支結扎法可建立急性心肌梗死合并抑郁大鼠模型。焦慮、抑郁可抑制心肌梗死發生后骨髓c-kit+干細胞的動員，且這一過程可能與炎癥反應增強有關。本研究揭示了焦慮、抑郁影響冠心病預后的部分機制，但仍需從細胞實驗角度對本研究結論進行驗證。